类风湿性关节炎分期诊断和TGF-β1分子表达的相关性研究

类风湿性关节炎分期诊断和TGF-β1分子表达的相关性研究

[摘要]目的：探究转化生长因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）分子表达与类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis，RA）分期诊断的相关性，为早期RA分期诊断提供新的诊断指标和理论依据。方法：收集2018年01月至2018年12月在成都医学院第一附属医院就诊的RA患者样品60例以及同期正常样品20例，根据临床诊断打分和实验诊断结果对RA患者样品60例分活动Ⅰ期14例，活动Ⅱ期18例，活动Ⅲ期28例。运用流式细胞术（FCM）、反转录-荧光定量聚合酶链反应（RT-Q-PCR）方法、酶联免疫吸附分析（ELISA）方法对所有样本Th17细胞亚型，血液TGF-β1mRNA，血清TGF-β1蛋白进行检测分析。结果：研究表明，RA样本和正常样品相比，TGF-β1表达具有显著差异（P<0.05）。Th17细胞亚型，TGF-β1蛋白，TGF-β1mRNA结果与RADAS28活动分期的相关性分别为r=0.482，r=-0.256，r=0.490。结论：通过血液样本对TGF-β1分子表达检测，发现其与RA分期诊断具有相关性。且TGF-β1mRNA比Th17细胞亚型和TGF-β1蛋白结果更具有参考性，TGF-β1mRNA分子表达检测可以作为RA早期分期诊断指标，为临床RA早诊断早治疗提供理论依据。[关键词]类风湿性关节炎；分期诊断；TGF-β1；分子表达[通信作者]王近吴，女，硕士生，基础研究，E-mail：jinwuwang95@163.com；TelorrelationbetweenstagingdiagnosisandTGF-β1expressioninrheumatoidarthritisWang-Jinwu1,Zhang-Xinmao1（ChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan,610500,P.R.China）【Abstract】Objective:Toinvestigatethecorrelationbetweentheexpressionoftransforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)andthediagnosisofrheumatoidarthritis(RA),andtoprovidenewdiagnosticindicatorsandtheoreticalbasisfortheearlystagediagnosisofRA.Methods:WeCollected60RApatientsand20normalsamplesfromthesameperiodintheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollegefromJanuary2018toDecember2018.Accordingtoclinicaldiagnosisscoresandexperimentaldiagnosisresults,60patientswerepidedintodeseaseactivities.Therewere14casesinstageI,18casesinstageII,and28casesinstageIII.WehaddetectedTcellsubtypes,TGF-β1proteinandTGF-β1mRNAexperessionlevelforallsamplesbyFlowcytometry(FCM),enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),fluorescencequantitativepolymerasechainreaction(RT-Q-PCR)methods.Results:StudiesshowthatthereisasignificantdifferenceintheexpressionofTGF-β1proteinandTGF-β1mRNAbetweenRAsamplesandnormalsamples(P<0.05).ThecorrelationofTh17cellsubtype,TGF-β1protein,mRNAandRADAS28activitystagewasr=0.482,r=-0.256,r=0.490.Conclusion:WefoundthattheexpressionofTGF-β1moleculehasacorrelationwiththediagnosisofRAstaging.Moreover,TGF-β1mRNAisbetterthanproteinresults.TGF-β1moleculeexpressioncanbeusedasanearlydiagnosticmarkerforRAanditprovideatheoreticalbasisforearlydiagnosisandearlytreatmentofRA.【Keywords】RheumatoidArthritis；stagingdiagnosis；transforminggrowthfactor-beta1；molecularexpression类风湿关节炎（（RheumatoidArthritis，RA）是一种常见的骨关节滑膜炎系统性自身免疫性疾病，多见于女性[1，2,3]，多见于女性，全球患病率达到1%[4]。其主要表现为关节滑膜的慢性炎症、增生形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等[1，5-9]，是一种对称性、慢性、进行性多关节炎。RA造成关节结构破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，对患者生活自理能力产生严重影响，给国家医疗造成严重负担。现行研究RA发病机制除与遗传和环境相关外，涉及复杂的细胞免疫及体液免疫反应，具体致病机制不清楚[10]。多项研究表明RA患者外周血Th1、Th2、Treg和Th17亚细胞群间存在的动态平衡及交互抑制作用被打破，RA的早期发生与Th1/Th2细胞的失衡有关，后期发展与Th17/Treg细胞的失衡有关系[11-13]。我们推测机体处于Th1/Th2/Treg/Th17其中一种或几种细胞占优势的漂移现象，这可能是导致RA全身及关节局部炎症持续的原因之一。临床主要通过定量的实验诊断结果和定性的患者病理情况对RA患者进行诊断和分期，由于RA活动期症状和静止期不同，且表现多样，实验诊断和病理情况不能很好地对处于活动期的RA进行分期诊断。免疫初始T细胞分化不平衡与参与RA致病过程的众多关键细胞因子分泌紊乱有关，前人研究表明参与RA致病过程的关键细胞因子很多，包括了多种白介素（如IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17，IL-21，IL-23）、干扰素（Interferon，IFN）、转化生长因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）和肿瘤坏死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）等[14,15]。其中转化生长因子（TGF-β1）的表达异常与Th1/Th17和Th17/Treg细胞的分化失衡密切相关[10,16]。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种对细胞成熟、增值，分化具有双重调节作用的多功能因子[17]。TGF-β1通过smads蛋白传递信号，它的表达几乎关系到RA病情发生、发展、治疗、预后及转归的全过程，其作用复杂多样。所以TGF-β1基因的表达与RA患者的免疫状态息息相关，并影响RA的病程[18,19]。1资料与方法1.1一般资料收集成都医学院第一附属医院RA病人60例(全部为女性，平均年43±8.7)，健康人群20例（全部为女性，年龄在40±7.6岁之间）清晨空腹静脉血2ml左右两管，活动期必须同时满足下列条件：（1）4个或以上的关节肿胀；（2）6个或以上的关节触痛；（3）符合下面两条标准中任意1条：随访当日晨僵持续时间≥45min，血沉（魏氏法）≥28mm/h，C反应蛋白（C-Reactiveprotein，CRP）>10mg/L[20,21]。所有病人均符合2010年美国风湿病学会的RA分类标准[22]；排除非RA标准：无其他严重病史者；3个月以内未接受过生物制剂或关节皮质类固醇治疗。临床评估包括压痛和肿胀关节数，DAS28评分和实验室指标红细胞沉降率（ErythrocyteSedimentationRate，ESR）[6]、CRP、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸肽抗体（AntiCyclicCitrullinatedPeptideAutoantibody,ACPA）。RA组与健康对照组两组间的性别以及年龄比均衡性检验皆显示无差异[20]。1.2方法分别对血液样本进行了T细胞亚型FCM分析、TGF-β1蛋白ELISA检测和mRNA荧光定量PCR检测。1.3相关统计学处理所有数据采用GraphPadPrism7.0软件分析和作图。结果数值用(x±s)表示，不同组间比较采用t检验和方差分析，不同组间数据相关性分析采用Spearman相关分析[23]，最终统计结果以(P<0.05)为差异有统计学意义。2结果2.1样本分类和实验诊断指标结果收集成都医学院第一附属医院RA病人60例，健康人群20例血液样本。对60例RA患者标本应用疾病活动评分DAS28分成RA活动期Ⅰ期（DAS28≤3.2），RA活动期Ⅱ期（3.2<DAS28≤5.1）和（DAS28>5.1）。正常样本和RA活动期样本之间，年龄，疾病持续时间并无统计差异，血沉ESR，类风湿因子RF和抗环瓜氨酸肽自身抗体(ACPA）在RA活动期Ⅱ期和Ⅲ期并无统计学差异。(见表2-1)表2-1样本分类和实验诊断指标正常样品RA活动Ⅰ期RA活动Ⅱ期RA活动Ⅲ期例数（例）20141828年龄（岁）37±5.236±3.538±4.742±4.1疾病持续时间（年）--3±1.23±1.44±1.1血沉(mm/h)--32±8.447±6.548.5±16.0内风湿因子（阳性率）--6/14(42.9%)14/18(77.8%)22/28(78.6%)抗环瓜氨酸肽抗体（阳性率）--4/14(28.6%)8/18(44.4%)11/28(39.3%)DAS-28score--DAS28≤3.23.2<DAS28≤5.1DAS28>5.1注：数值用平均值±标准差表示，数据统计用t-检验方法,--表示无或未检测到结果，∗P<0.05表示具有统计学差异。2.2血液样本T细胞亚型FCM处理结果收集成都医学院第一附属医院RA病人60例，健康人群20例血液样本，通过流式细胞术对Th1，Th2,Th17和Treg细胞进行分选和计数。以同型对照标记为对比，计算各血液T细胞亚型相对频率。Th1和Treg细胞亚型RA活动Ⅲ期对正常样本具有统计学差异（P<0.05），Th2细胞亚型无统计学差异。Th17细胞亚型RA活动Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期对正常样本都具有统计学差异（P<0.05）。(见表2-2)表2-2血液样本T细胞亚型相对频率组别Th1cell(%)Th2cell(%)Th17cell(%)Tregcell(%)RA样本7.2±4.8∗1.6±0.81.2±0.9∗1.9±1.1∗RA活动Ⅰ期6.1±3.71.9±0.50.9±0.5∗2.6±0.6RA活动Ⅱ期5.8±4.51.8±0.41.1±0.6∗1.7±1.3RA活动Ⅲ期6.9±4.8∗1.8±1.01.3±1.0∗1.5±1.1∗正常样品2.6±1.31.6±0.90.6±0.32.7±1.7注：数值用平均值±标准差表示，数据统计用t-检验方法,∗P<0.05表示具有统计学差异。2.3血清样本TGF-β1蛋白ELISA检测结果对收集到RA病人60例，健康人群20例血清样本ELISA检测TGF-β1蛋白结果显示，总体RA样本TGF-β1蛋白浓度表达和健康对照组相比低40pg/ml，但P>0.05无统计差异。RA活动Ⅰ期和Ⅲ期跟健康对照组相比也无差异，值得注意的是RA活动Ⅱ期TGF-β1蛋白浓度表达较低，跟健康对照组相比，P<0.05有统计学差异。(见表2-3)表2-3血清RA活动组与健康对照组TGF-β1水平比较（x±S）组别例数TGF-β1（pg/ml）RA样本60328.36±16.89RA活动Ⅰ期14367.55±23.06RA活动Ⅱ期18286.28±12.58∗RA活动Ⅲ期28321.24±14.20∗健康对照组20368.36±15.45注：数值用平均值±标准差表示，数据统计用t-检验方法,∗P<0.05表示具有统计学差异。2.4血液mRNA荧光定量PCR检测结果对收集到的60例RA病人血样和20例健康人群血样，提取RNA,反转录荧光定量PCRTGF-β1后，根据CFX96本身软件采用2-∆∆Ct的相对定量计算方法，结果表明RA样本TGF-β1转录子相对表达量低于正常样本组。而且根据RA活动期加强，TGF-β1转录子相对表达量成负相关性，都差异低于正常样本组，而且组间差异P<0.05,有统计学差异。(见图2-1)图

2-1：TGF-β1mRNA的相对表达量比较注：control为正常对照组，RA1为RA活动Ⅰ期，RA2为RA活动Ⅱ期，RA3为RA活动Ⅲ期，∗P<0.05表示具有统计学差异。2.5散点图相关性分析根据RA患者分期样本和正常对照组样本的流式结果（Th17），ELISA结果，荧光定量PCR结果，对应DAS28分期样本，运用采用Spearman相关分析方法，进行组间相关性分析。流式Th17细胞频率结果显示，和RA患者严重程度成正比，且各组间具有统计学差异（P<0.05）。ELISATGF-β1蛋白表达结果显示，RA活动Ⅱ期、RA活动Ⅲ期和正常对照组相比表达降低，有统计学差异（P<0.05）。荧光定量PCRTGF-β1mRNA相对表达结果显示，和RA患者严重程度成正比，且各组间具有统计学差异（P<0.05）。荧光定量PCR结果与流式（Th17）结果相比，与DAS28分期的相关性要高（r=0.490VSr=0.482）。(见图2-2)图2-2：检测结果与DAS28分期的相关性散点图注：control为正常对照组，RA1为RA活动Ⅰ期，RA2为RA活动Ⅱ期，RA3为RA活动Ⅲ期，∗P<0.05表示具有统计学差异。3讨论类风湿关节炎（RA）是一种较为常见的系统性自身免疫病，全球流行，但具体致病机制尚不清楚[24-26]。目前RA的临床诊断一般是通过定性的临床病理分析和定量的检验指标。本文通过定性病理分析，对照样本，比较了RA与正常人的组间差异和不同活动期的相关性。TGF-β1低浓度时与IL-6联合作用促进分化为Th17细胞，单独高浓度时促进分化为Treg细胞，而Th17/Treg的平衡影响RA的病情进程[27,28]。同时TGF-β1蛋白表达受TGF-β1基因和mRNA表达的影响，而且与转录后修饰和翻译调控有关。患者RA和正常样本血细胞TGF-β1蛋白表达水平在不同的研究中，结果有差异。RA患者血液中TGF-β的水平明显低于正常人,因此RA患者下调免疫活动的功能下降,自身免疫反应异常,自身抗体及免疫球蛋白合成增多[29,30]。TGF-β1对RA患者起到很重要的保护作用,它的减少导致RA患者自身免疫紊乱[29]。正常人群各细胞因子和T亚群细胞正常分泌行使功能，而RA患者各细胞因子分泌紊乱，导致T亚群细胞分化失衡，分化失衡反过来也影响各细胞因子的分泌[31-34]。TGF-β1基因的表达与RA患者的免疫状态息息相关。其作用形式多样，生物功能复杂，单独存在时和与其他细胞因子共同作用的时候，对人体免疫细胞的分化和发展影响完全不一样。因此，TGF-β1的分子表达与类风湿性关节炎的关系值得我们去研究。分析TGF-β1检测结果与类风湿性关节炎不同活动期的相关性，鉴定分析对于评价RA早期诊断分期具有临床意义的分子表达指标，有助于临床早期诊断RA和其分析用药，最终为探究RA的发生与发展关系，研究TGF-β1分子表达在RATh17/Treg细胞分化平衡中的作用机制，对早期诊断、评价病程发展提供借鉴，为治疗RA提供实验理论依据。参考文献[1]左进红.中成药治疗类风湿性关节炎的网状Meta分析[D].广州中医药大学,2018.[2]陈磊,汪元,潘惠,刘佳佳,梁红.类风湿关节炎合并心血管疾病的危险因素分析[J].中华中医药杂志,2019,34(01):328-331.[3]胡筱娟,程红卫,秦艳,刘恬园,刘亚东,张冠杰.青白通痹胶囊联合小剂量甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎的临床效果[J].临床医学研究与实践,2019,4(02):111-112+121.

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