DB21T 2734.2-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第2部分：产气荚膜梭菌PCR 分型检测方法

DB21DB21/T2734.2—2017病菌PCR分型诊断方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart2：MethodofPCRtypingdetectionforClostridiumperfringens2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2734.2—2017 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 5A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶 5A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸) 5 5DB21/T2734.2—2017本部分为病菌PCR分型诊断方法的第2部分。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、1DB21/T2734.2—2017本标准规定了产气荚膜梭菌A、B、C、D、E五型PCR检测方本标准适用于产气荚膜梭菌病的诊断、监测及流行病学调查，适用于动物粪便、肠内容物及纯本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB/T4789.13食品卫生微生物学检验产气GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安SN/T2025-2007动物检疫实验室生物安DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（basepair）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外2DB21/T2734.2—2017微量移液器和吸头等。6.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-6.9TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳用于PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列及扩增产物大小见表1。F5’-TTACTGCCGTTGATAGCG-3’R5’-TCATTTCCTGGGTTGTCC-3’F5’-TTTCCGGTTAGATACTCGAT-3’R5’-ACAGTTTCTTTCACGCTCCA-3’F5’-CTCATAATGTCCCTTCAC-3’R5’-CTCATCTCCCATAACTGCT-3’F5’-AATGGCGATGAAAAGCCTACAC-3’R5’-GCATAACCTGGAATGGCTGATA-3’F5’-TAGAATCAAATACCGCTGGTGA-3’R5’-CTGGATATGCTGCAACTAAAGG-3’7.1样品的采集、前处理、存放与运输采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样3DB21/T2734.2—20177.1.3肠内容物的采集与前处理无菌采取病死或剖杀动物的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕10倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置30min，12000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病动物的新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕10倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置30min，12000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.5产气荚膜梭菌纯培养物依据GB/T4789.13和SN0177进行产气荚膜梭菌的分离培养。挑取产气荚膜梭菌菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用。采集或处理的样品应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在4h之内运送到实验室检测；无冷藏条件的，于采样后2h内送达实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照7.2.1.3取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取900μL上清液转移至相应的管7.2.1.44℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙7.2.1.54℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。建立25μL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：灭菌蒸馏水17.375μL10×PCRBuffer2.5μL2.5mmol/LdNTP2μL4ExTaqDNA聚合酶上游特异性PCR引物下游特异性PCR引物DNA模板DB21/T2734.2—201794℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min。将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）板点样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。8试验成立的条件当试验结果同时符合以下条件时试验成立，否则实验结果无效：阴性对照未出现特异性条带；A型产气荚膜梭菌阳性对照出现475bp的α-毒素扩增条带；B型产气荚膜梭菌阳性对照出现475bp的α-毒素、513bp的β-毒素和272bp的ε-毒素扩增条带；C型产气荚膜梭菌阳性对照出现475bp的α-毒素和513bp的β-毒素扩增条带；D型产气荚膜梭菌阳性对照出现475bp的α-毒素和272bp的ε-毒素扩增条带；E型产气荚膜梭菌阳性对照出现475bp的α-毒素、692bp的ι-毒素A和111bp的ι-毒素B扩增条带。9结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，试验条件成立时，实验结果可作为判定依据。如被检样品中出现预期大小的扩增条带，则可初步判断被检样品中含有对应的产气荚膜梭菌毒素基因，初步判断为阳性结果的样品可通过复检和核酸序列测定进行确认。如被检样品中未出现预期大小的扩增条带，则可判断被检样品中不含有对应的产气荚膜梭菌毒素基因。5DB21/T2734.2—2017 A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（Ph8.二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯）灭菌双蒸水氢氧化钠灭菌双蒸水A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍)羟基甲基氨基甲烷(Tris)（分析纯）242g