SN∕T 4853.7-2017 转基因大米定量检测数字PCR法 第7部分：T1C-19品系

转基因大米定量检测数字PCR法I 本部分为SN/T4853标准的第7部分。1本标准规定了稻谷和大米中T1C-19品系的数字PCR定量检测方法。本方法的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T19495.7转基因产品检测由样和制样方法SPS基因Thegeneofsucrosephosphatesynthase外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。2依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列(eventspecificsequence)和内参照基因(species3扩增基因名称序列(5'-3')片段长度SPS基因上游引物下游引物VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA体特异性序列上游引物下游引物FAM-TGTTTGCTTGGCTGTTTGCTCTCT注1:表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进4按照GB/T19495.7的规定执行。采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。8.4.1数字PCR体系配制终浓度内源基因反应体系SPS基因荧光标记探针(10pmol/L)dH₂O(无菌水)5表2(续)终浓度外源基因反应体系dH₂O(无菌水)注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家，型号的数字PCR仪作相应调整。PCR量避免产生气泡。作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃,环；12℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测，记录阳性和据比值分别计算数字PCR反应体系中的SPS基因拷贝数(拷贝/pL)和TIC-19转化体特异性序列拷贝a)NC:采用非转基因大米的基因组DNA作为数字PCR反应模板；b)NTC:采用水作为数字PCR反应模板；c)PC:采用质控样品的基因组DNA作为数字PCR反应模板。每个测试样和PC的SPS基因或T1C-19转化体特异性序列的数字PCR须设置至少3个平行，且3个平行实验结果的相对标准偏差应不高于20%。b)PC的SPS基因或T1C-19610.1数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和T1C-19转化体特异性序A——转基因大米品系T1C-19的含量(%);10.2如两个测试样的T1C-19品系含量的相对相差大于或等于35%,则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T10.3如两个测试样的T1C-19品系含量的相对相差小于35%,则样品的定量检测结果等于两个测试未检出SPS基因检出SPS基因，但未检出T1C-19转化体特异性序列检出转基因大米T1C-19品系成分，但的LOQ(0.1%)转基因大米T1C-19转化体特异性序列GATAAGCCAGGAGCAACTGT