活细胞分析在免疫学中的十大应用

SR正OZIUS免疫细胞体外分析的主要方法包括流式细胞术、PCR以及各种形式的ELISA（如ELISPOT）。这些技术加在一起，可以从分子水平上对不同的细胞群的功能进行检测，并对免疫反应进行量化，例如，细胞因子的释放。虽然这些平台非常强大，但近年来，实时活细胞分析已成为免疫学研究重要的研究方法，突破了传统方法的诸多限制。在这里，我们总结了10个活细2活细胞分析是利用延时成像（数小时至数周）对活细胞的2.在整个实验过程中将细胞维持在不受干扰的稳定的生理CultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiCultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiSingletimepoint赛多利斯推出专业的活细胞分析系统Incucyte®,可以自动收集、分析和展示2000多个平行实验（如6x384孔微孔不是细胞板），这样就可以在不干扰细胞的情况下捕捉非贴壁细胞的高质量图像。另外，搭配优化的活细胞试剂、SingletimepointMonitorefectoftreatment(e.g.,diferentiation,drugtreatment)3作用。该方法适用于所有类型的免疫细胞，包括T细胞、免疫细胞可以通过一些不同的方式进行非侵入式的活细胞可以作为细胞数量的代表性方法（图2）。至少达到80%的汇合度，这个数据指标与细胞直接计数法和ATP荧光检测的结果高度一致，证明了此数据的可靠性。但是，对于密集的培养物，或者考察单个细胞区域随时间的变化，这种相关性会减弱。此外，也可以使用荧光标签，如核靶向荧光蛋白（如Incucyte®NuclightLentivirus）或非干扰染料（如Incucyte®CytolightRapidDye）。细胞核计数能够对细胞数量进行精准测量，即使细胞被挤在一起，荧光标在最近的发展中，可以使用新的图像分割工具（Incucyte®和形状（偏心度）等指标在单个细胞水平上对视野中的所有细胞进行计算，并使用类似于流式细胞仪中使用的“散并对细胞群中单个细胞的参数更深入地了解。无论采用哪种方法，都能产生完整的时间过程数据、洞察有价值的细荧光标记的CD抗体（Abs）被广泛用于流式细胞仪，用于细胞识别和免疫分型。基于这些特征，至少有15种人类T细胞亚型被描述出来（例如，CD4+，CD8+，等等）。现在已经开发了使用相同原理的活细胞分析方法。与其使用直接标记的Abs，不如将抗CD的Abs结合到同型匹配的带有荧光标签的Fc区域靶向Fab片段（如Incucyte®），Confluence,24h1005025040K20K0244872965040K20K0244872964在检测中使用一种非干扰性的背景荧光抑制染料，以帮助改善488nM的荧光信号。然后将Fabfluor-488标和抑制剂直接加入到细胞中，只有表达表面标志物的细胞才会发出荧光。然后，细胞亚群可以很容易地被识别并随CD4+、CD8+）的百分比，并将形态学属性与不同的亚群联系起来，并且测量细胞占比随时间的变化。更有用的是能够观察培养物中细胞亚群之间的相互作用--例如，在基于PBMC的免疫细胞杀伤实验中，CD8+细胞毒性T细胞免疫细胞的分化和激活是免疫力和免疫应答的关键步骤。细胞通过受体信号传导进行扩增并产生功能效应，最终导致基因表达、分化和表型变化。活细胞分析很适合研究其复杂性和动态性。在一个简单的案例中，我们评估了化合剂诱导的人类中性粒细胞的激活（图3）。图像分割工具用Fabfluor-488/Ab复合物进行定量）的时间和浓度依赖性的变化。这些变化的时间过程相似（0-6小时），偏心度在进一步分析中，我们检测了刺激诱导人THP-1单核细胞向巨噬细胞的分化。对照组（未处理）和受刺激的THP-1细胞中，随处可见的细胞表面标记物CD45在三天的监测过程中没有任何的变化。CD45可被认为是一个稳定的"管家"蛋白。在控制条件下，THP-1细胞在长达72小时内几0.60.50.4Vehicle0.60.50.4log[CXCL8](M)0.80.60.40.04nMvehicle,02460.80.60.4log[CXCL8](M)图3:中性粒细胞激活的量化。将新鲜分离的人中性粒细胞以40,000/孔接种在涂有Matrigel®（50μg/mL）的96孔板中，并在Fabfluor-488标记的5分化剂，如维生素D3、IFNγ+m4）。维生素D3没有上调CD40。仔细观察细胞图像，只有PMA使细胞形态产生了明显的变化，产生了大的、扁平的、粘附的"巨噬细胞"样细胞。只有那些用PMA处理的这些数据共同说明了如何使用Incucyte®一种检测工具来同时检测表面蛋白标志物、细胞形态和功能随时间的变化，上述应用也可以通过使用专为活细胞分析而优化的荧光染料，与细胞凋亡或细胞健康读数进行关联。例如，细胞凋亡可以通过磷脂酰丝氨酸外翻（Incucyte®AnnexinV胞非通透性的DNA结合荧光探针（如Incucyte®CytotoxRedDye）可用于检测细胞膜的完整性。活细胞分析的实时读数提供了对细胞凋亡、细胞死亡的时间过程以及它们与细胞增殖的关系的洞察（Artymovich和Appledorn，UndiferentiatedVitaminD3(50nM)ProliferationVitD3Undiff.VitD350250244872log[CXCL8](M)80604020080CD4060402000244872806040200024487200244872VitD3Undiff.log[CXCL8](M)CD14或CD40复合的情况下暴露于培养基（未分化明显变化（高清相差图像）。动力图突出了各种处理条件下不同的、随时间变化的表面蛋白表达。了细胞增殖（汇合）的减少和吞噬潜力的增加，这是通过用pHrodo®红细胞标记试剂盒标记的凋亡Jurkat6可能不同（例如，释放细胞因子、细胞毒性颗粒或ROS、Fas/FasL相互作用），但最终这些免疫防御者通过细胞裂监测其红色荧光的损失。例如，THP-1细胞被核靶向RFP稳定转染后转移至96孔板上。加入预激活的PBMCs（抗），的裂解，最终完全失去RFP信号。细胞溶解的速度取决于查细胞图像得到验证，显示膜破坏、运动能力丧失和目标细胞的收缩。类似的检测原理可以应用于肿瘤球的杀伤。在图5中，Incucyte®NuclightRedA549肿瘤细胞在加入PBMCs之前，在超低吸附板（ULA）中形成并生长3天形成3D球细胞模型。随着时间的推移，PBMCs裂解了球状这种形式可以扩展到在第二荧光通道中直接测量目标细胞的凋亡（McCormack,etal.,2013）。只要效应细胞比目标细胞小，任何来自PBMCs的凋亡信号都可以通过荧光对象的尺寸门控来排除。为了说明这一点，CD8+细胞毒性T细胞与Incucyte®NuclightRedA549细胞在Incucyte®Caspase3/7染料（5mM）存在下共同培养在96孔板上。在此应用案例中，T细胞杀伤开始大约需要48小时，同时），这些方法对于表征检查点抑制剂、CAR-T细胞、双特异性++Anti-CD3/IL-2(10ngmL)A549+PBMCs30200A549Alone+AntiCD3/IL-2TimeAfterPBMCAddition(h)HD相位和荧光图像比较了在没有（非激活，上7微生物（如微生物病原体）和外来的、垂死的细胞被灭活并从体内清除。免疫系统的专业吞噬细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞、Kuppfer细胞、小胶质细胞和未成熟的树突状通过检测其荧光标签来进行。其中非常重要的是要区分吞噬作用和非特异性的细胞吸收或表面结合的非内化标签。Incucyte®已经开发了使用pH值敏感染料（如pHrodo®)标记活细胞分析方法，该标签与细菌壁蛋白或目标细胞连在第一个例子中，通过加入pHrodo®绿色标记的大肠杆菌细胞内的荧光随着时间的推移（24小时）而增加，因为生物颗粒被内化了（图6）。在对照实验中，如果没有粒或使用非吞噬细胞（如A549），则观察不到荧光（数据未显示）。细胞吞噬作用的抑制剂，包括细胞松弛素D和为了说明哺乳动物细胞的吞噬作用（"胞葬作用"），我们描述了抗CD47抗体介导的小鼠骨髓巨噬细胞对CD47+CCRF-CEMT淋巴细胞的吞噬。CD47是一种跨膜是一种有希望的免疫治疗新方法。抗CD47抗体（0.04-5），0’30’240’10-3ou10-3oug/wel3pg/welloug/wel2.00.50.00.80.40.00.04ugmL20o o o0.2ugmL0.04ugmL0031030Bioparticle(ug/well)TreatmentGroup值得注意的是，吞噬作用取决于生物颗粒的数量（B）。使用Incucyte®的pHrodo®红细胞标记抗CD47的情况下，目标细胞被骨髓来源的巨噬细胞吞噬，增加了荧光信号并产生了浓度依赖8这两种情况下，信号窗口都很大，而且吞噬可以通过可视化来验证。这种功能验证分析可用于筛选新的CD47调节御感染的机制之一。当中性粒细胞遇到入侵的病原体时，它们会释放出一种抗菌蛋白和染色质的混合物来捕获和降解微生物。活细胞分析可以通过使用荧光DNA结合试剂实当使用NETosis诱导刺激物（如PMA、IO理中性粒细胞时，荧光强度迅速上升，细胞边界会显示降解的DNA云或光晕（图7）。可以观察到细胞核的退化和外翻，以及活性氧（ROS）检测进行关联，可以阐明个重要组成部分。中性粒细胞、单核细胞、T细胞和小胶质细胞都会以这种方式被吸引到病原体和炎症刺），检测趋化作用。新型的transwell在每个孔中都有精确的激光钻孔供细胞移动通过。与传统的Boydenchamber实验不同的是，当细胞向化学试剂移动时，可以对其进行可视化和量化。与早期的应用一样，这种方法能够更深入地洞与-Boydenchamber实验相比，所需的细胞数量要少得多0d0h0m0d0h32m0d1h2m0d2h2m550.50.03343220002460.013YM0.04YM0.37UM3.33UMnM图7：NETosis的量化。在Incucyte®Cytotox绿色染料（250nM）和CellROX®DeepRed（5μM，ThermoScientifi处理新鲜分离的人中性粒细胞。相位和荧光图像显示（A）活性氧（ROS，红色，0-2小时）的瞬时产生，细胞核的解聚（30-60分钟）和细胞外DNA9在体外测量病毒在哺乳动物细胞中的感染性和复制能力对免疫细胞佐剂至关重要。与传统的蚀斑实验和病灶形成实验相比，活细胞分析可以通过计算被荧光蛋白（如GFP）标记的病毒的细胞数量和程度来自动量化病毒的传播和复这种方法已在一系列病毒研究中被使用并发表，包括），也可以检测细胞的凋亡或坏死程度。Incucyte®活细胞分析工作流程的一个有趣的优点是，当添加病毒或病毒复制体到细胞后，培养板不需要离开培养箱。因此，即使是高度传染性的病毒也可以在适当的生物隔离设施中安全地进行单克隆抗体（mAb）和抗体偶联药物（ADCs）被广泛用于这些生物制剂的一个关键特性是内化到不同细胞中的程度活细胞分析可以在96孔板中检测Ab内化。使用对pH值敏感的荧光染料检测Ab进入酸性溶菌酶的内化，其思路与®Fabfluor-pH染料）实现的，只需一步，无需洗涤，提供高效、高通量的样品制备。为了证明这一点，用