GBT 28630.2-2012 白斑综合征(WSD)诊断规程 第2部分套式PCR检测法

第2部分：套式PCR检测法I 第1部分：核酸探针斑点杂交检测法 第3部分：原位杂交检测法 本部分为GB/T28630的第2部分。GB/T28630.4—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法24.1210μmol/L引物F1:5'-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG-3',外侧正向引物wSSVDNA的1447bp产物，-20℃保存。类动物DNA中8481p的片段，-20℃保存类动物DNA中84sbp的片毁4.27阳性对照为已知受WSSV感染且PCR结果显示明显阳性结果的wssyDNA模板，-20℃4.28阴性对照为已知未受wSSV感染且PCR结果显示阴性结果的对虾组织DNA模板，-20℃5.6手掌型离心机：用于PCR后区对0.2mLPCR管的离心，塑料转头，转速2000r/min~350μL体系10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液(无Mg²+)氯化镁溶液(25mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)100份反应预混物总体积表2100份第二步PCR的反应预混物所需试剂组成25pL体系10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液(无Mg²+)氯化镁溶液(25mmol/L)10pmol/L引物F24表2(续)50μL体系TagDNA聚合酶(5U/μL)100份反应预混物总体积注：25pL体系模板量2.56.2.4将上述待检样品放入灭菌1,m微离食重应避免各样品回的交叉房染，所有非一次性6.3.2在样品剪碎后加入抽提缓冲液500pL,用研磨棒充分研磨37℃温浴1h。6.3.8用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心倾去上清，最后沉淀于室温56.5.1第一步PCR6.6.1.2将凝胶液缓缓倒入设置好样孔梳和防漏条/套的水平放置的凝胶船，胶液厚度0.6cm~6际测量的结果允许有1%～3%的误差。问题排除十足类动物样品848bp处有条带。被检生物样品照无任何条带；带，阴性对照和空白对照无任何条带。阳性样品第一步PCR后在1447bp处有条带或第二步PCR后在941bp处有条带。阴性样品第一步PCR后在1477bp处无条带且第二步PCR后在941bp处无条带7表3(续)结果判读及原因分析问题排除阳性对照有条带，但Marker没有影像以及PCR程序是否正确阴性对照组在1447bp或941bp处有条区的微量移液器跑电泳更换试剂禁止从PCR后区到PCR前区的交流，禁止从电泳区到PCR操作区物样品中无任何条带(包括无848bp条带)DNA不纯致使PCR抑制物用OD₂so/OD₂so比值来确定。其可见1447bp条带，则记录该样品品出现较多杂带或明显的弥散区出现非特异性扩增做好热启动操作。样品先要加或Mg²+浓度差异佳Mg²+离子浓度8表3(续)问题排除中30min后再观察结果重新制作琼脂糖凝胶片电极颠倒或电泳时间过长重新配置溴化乙锭(EB)溴化乙锭(EB)有毒，试剂的操作和废弃物的处理按附录B的规9试剂配方溶解后加入约42m袁盐酸调口时接近3.0,冷却至室温，再用5mol/L盐酸调整pH至8.0。99加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2,加水定容至100mL。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上蛋白酶KA.9酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)在500/mL永中加入室温亡存置于聚丙烯塑料瓶酸电泳区。洁净区和样品区属于PCR前区，扩增区和电泳区属于PCR后区。其中洁净区专用于配制和触任何PCR产物；扩增区专用于进行PCR循环和第二步PCR于PCR产物的检测。只允许从洁净区→样品区→扩增区→电泳区的单向物流，同时PCR后区应尽可B.2含PCR反应产物的材料胶和手套等应用3.0×10-³浓度的含氯消毒剂溶液处理后，再以塑料袋密封包装后丢弃，含有PCR反应产物的溶液应加入含氯消毒剂达3.0×10-³的浓度，经处理10min以上后方可直接倒入下水道口。只能密封保存在PCR后区。加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/mL以下。加入1倍体积的0.5mol/L高锰酸钾，小心混匀后再加1倍体积的2.5mol/L盐酸。小心混匀，于室温放置数小时。加入1倍体积的每100mL溶液中加入100mg粉状活性炭。于室温放置1h,不时摇动。用Whatmanl号滤纸过有强腐蚀性，操作时要穿戴实验服及手套。应避免吸入或食入。直接的皮肤接触应立即用大量清B.5电泳电泳时会产生100V～600V的直流电压，同时电极处会产生大量的微小气泡。应盖好电泳槽上盖以避免气泡炸裂导致PCR产物的污染和有毒试剂的挥发。避免接触电极及液面以防触电。B.6紫外线(资料性附录)白斑综合征(WSD)套式PCR检测产物序列121TCCCATACAAAGTCATCTTTCATGGACAACAT241ATGTCCCACAAGCAAAATTGTAACTGCCCC301GATAACGAGCATCTGGTATCCTCTTT421ATGTCCAAGATCGATTCTAGAGTAAC481ACTGA