饲料中猪源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 编制说明

实时荧光PCR法》（征求意见稿） 1 10 11 15 16 17 2.3.8绝对检测限（Absolutelimitofdetection)测试 2.3.9相对检测限（Relativelimitofdetection)测试 202.3.10方法的稳健性（Robust 26 26 29 1），表1我国主要动物源性成分检测标准汇总标准类别国家标准饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法检验检疫行业标准时荧光PCR法2时荧光PCR法时荧光PCR法农业部转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bo海关规范轻工标准地方标准黄羊源性成分检测实时荧光PCR法牛和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和马源性成分同步检测方法实时荧光PCR法牛和猪源性成分同步检测方法实时荧光PCR法马源性成分检测方法实时荧光PCR法绵羊和山羊源性成分同步检测方法实时荧光PCR法饲料中羊源性成分检测方法（荧光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法食品中马、驴源性成分定性检测方法实时荧光PCR法3食品中鸡、鸭源性成分定性检测方法实时荧光PCR法GB/T21101-2007标准中PCR循环圈数仅为35个循环（而实时荧光PCR在海关日常的进口饲料检测中，检测人员使用检验检疫行业标准《SN/T2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》检测出猪成分出现阳性结果需要退货或销毁时，客户会提出使用国家标准GB/T后，酶切片段大小为196bp和16酸提取、PCR扩增、凝胶电泳、酶切反应、凝胶电泳等五步，步骤繁杂，不利GB/T20190-2006需要电泳，电4号1Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检2Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR3Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR4Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR5Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR6Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR7Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR8Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR检测方法第8部分—火鸡DNA检测方法9Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsin5method.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物标记分析食品和饲料中动物源性成分实时荧光PCR表3标准主要起草人员和任务分工6公司代表起草小组介绍了对国内外相关分析方法的研究，标准制定的技术路线72024年4月，标准编制小组完成标准文本、编制说明定向征求意见稿编制位22个，回函单位20个，未回函单位修改、完善标准文本和编制说明，委托国家食品质量检验检测中心（上海）、8该标准在具有质量控制及检验水平的分子生物学实验内可以使用便于检测该检测方法的相对检测下限为0.1%（W/W)，绝对检测下限均为5拷贝参考ISO/TS20224-3:2020MolecularbiomarkeranalysisDetectionofanimal-derivedmaterialsinfPorcineDNAdetectionmethod《分子生物标记分析实时荧光PCR检测方法第1部分—猪DNA检测方法》等国内外标准和有关文除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水DNA提取试剂或DNA提取试剂盒、荧光定量PCR扩增实验配套试剂、蛋白9目标物种引物探针编号序列基因序列号18SrRNA参照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’NC_037354.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA参照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’18SrRNA参照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’18SrRNA参照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’猪Porcine-97bp-FF:5′-CGTAGGTGCACAGTAGGTCTGAC-3′DQ452569.1Porcine-97bp-RR:5′-GGCCAGACTGGGGACATG-3′Porcine-97bp-PP:5′-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[NFQ-MGB]-3′蛋白测定仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Eppendorf5425小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德国Memeert公司）；SPEX6850型冷冻碾磨机（美国SPEXSamplePrep公司）；QX100微粒式数字PCR仪（美国BioRad公司）；QX100微粒式数字PCR仪（美国BioRad公司）；分析天平（感接，得到质粒pUC57-t，转化培养。国产精补饲料阳性样品的制备：使用犊牛精料补充料，分别添加5%含量的国产浓缩饲料阳性样品的制备：使用种猪浓缩饲料，分别添加5%含量的猪国产配合饲料阳性样品的制备：使用对虾配合饲料，分别添加5%含量的猪核酸提取方法1：称取粉碎后的样品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附录C中核酸提取方法2：称取粉碎后的样品0.2~0.3g，使用天根生化科技（北京）为了保持检测结果的一致性和提取方法的简便性，本研究所用的DNA提取方法，除比较核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表5PCR实验反应体系—表6PCR反应程序反应温度反应时间循环数预变性95℃10mins195℃4060℃通过检测内参基因真核生物18SrRNA基因，可以判断样品所提取的DNA是否适合于PCR扩增。但目前关于18SrRNA基因检测，空白对照出现扩增曲实验样品包括：18种动物肉类、3种植物种子、3种细菌（原核生物），菌样品的基因组DNA用TE稀释至20ng/ul，猪皮明胶和明胶药壳的DNA提取表718SrRNA检测实验样品1鸽23马4驴5螺678鸡9猪鹅鸭猫鹿狗阴性对照（细菌）、空白对照（水）也会出现扩增，检测Ct值区域见表8。表8四套引物和探针检测Ct区域比较值1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探针进行检测，在样品），之间，阴性对照（金葡球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等原核生物）和空白对照在表9检测18SrRNA各样品的Ct值Ct值样品123456789均值1普通牛21.1021.1220.3421.0320.1520.8721.1721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0821.1220.3421.0420.2120.1920.4821.3320.623马20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驴19.0119.8819.5620.0120.3919.1819.7520.3319.8419.0719.705螺19.1219.8319.3220.2119.8720.4720.1919.5620.1419.3919.816绵羊20.1619.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078鸡21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339猪22.3522.3421.8922.7821.0922.1721.3922.7722.2922.0322.11鹅20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鸭18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99猫24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火鸡20.3621.2221.3220.1821.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.1721.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81骆驼20.7120.3921.1621.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.1720.6920.3319.0620.3519.7819.78鸽19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022猪皮明胶31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.1432.3331.8431.6023明胶药壳28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.1325.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4126.1225.8825.9225.4725.9625.7827曲奇饼干20.8120.0820.1220.1720.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.1732.3932.3332.1733.4533.1332.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0533.1832.5832.1133.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙门氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大肠杆菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControlO)40.1940.7740.1737.1537.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大连宝生物、华大基因、上海英骏生物技术有限公司、ThermoFisherScientific（3）本研究将上海生工生物工程公司合成的引物和探针干粉直接寄至上海本项目在深入研究的基础上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq的高度热稳定的DNA聚合酶。嗜热菌（Thermusaquaticus）是一种原核生物，按理说，是不能够扩增出18SrRNA的。但是在人工培养嗜热菌（Thermus合酶过程中，可能会含有少量的真核生物DNA。所以利用18SrRNA检测真核），假阳性；玉米DNA样品的浓度在0.000002ng/ul表10样品DNA稀释浓度及对应Ct值123456猪2.3.6.4利用数字PCR对梯度稀释的样品DNA进行检测结果显示，该结果同实时荧光PCR实验的结果保持一致，说明有效区分阳表11数字PCR反应体系PCR反应总体积样品4正/反引物探针0.5PCR扩增酶混合物水表12样品浓度与拷贝数123456猪22注释:“---”超出检测线性范围拷贝数明显高于猪细胞，前者高于后者60倍左右。35左右时，用于检测的样品DNA只有几个拷贝。表1318SrRNA、猪检测方法特异性测试物种种类动物普通牛(Bostaurus)+-印度瘤牛(Bosindicus)+-美洲野牛(Bisonbison)+-牦牛(Bosmutus)+-绵羊(Ovisaries)+-山羊(Caprahircus)+-骆驼(Camelusbactrianus)+-鲤鱼(Cyprinuscarpio)+-猫(Feliscatus)+-鸡(Gallusgallus)+-狗(Canisfamiliaris)+-驴(Equusasinus)+-鸭(Anasplatyrhynchos)+-麋鹿(Cervuscanadensis)+-金鱼(Carassiusauratus)+-鹅(Anseranser)+-马(Equuscaballus)+-小鼠(Musmusculus)+-恒河猴(Macacamulatta)+-鸵鸟(Struthiocamelus)+-野鸡(Phasianuscolchicus)+-猪(Susscrofadomesticus)++野猪(Susscrofa)++鸽(Columbalivia)+-鹌鹑(Coturnixcoturnix)+-兔(Oryctolaguscuniculus)+-大鼠(Ratusnorvegicus)+-虹鳟鱼(Onchorhynchusmykiss)+-火鸡(Meleagrisgallopavo)+-水牛(Bubalusbubalis)+-人(Homosapiens)+-植物苜蓿(Medicagosativa)+-玉米(Zeamays)+-油菜(Brassicarapa)+-大米(Oryzasativa)+-高粱(Sorghumbicolor)+-大豆(Glycinemax)+-小麦(Triticumaestivum)+-2.3.8绝对检测限（Absolut的拷贝数进行精确定量检测，准确稀释到1000拷贝/μL。将定量后的样品DNA都能100%检测到特异性DNA（表14），说明所建立的猪成分PCR检测方法的绝20表14猪检测方法的绝对检测限测试质粒样品DNA浓度/（拷贝/μL）靶序列拷贝数/（拷贝/PCR反应）阳性结果百分比（%)4215212.3.9相对检测限（Relativ将含有猪的肉骨粉粉末和不含有动物成分的精饲料碾磨成100目大小的粉状（W/W)的样品，每个浓度点设置12个重复。分别使用猪源性PCR成分检测方法进行检测，结果显示所建立的猪源性成分PCR检测方法在0.1%（W/W)时都能100%检测到特异性DNA（表15），说明所建立的猪源性成分PCR检测方法的相表15猪源性检测方法的相对检测限测试质量百分比（W/W，%）阳性结果百分比(%)5.02.00.10.0150.0%0.0010%方法进行检测，结果显示所建立的猪成分PCR检测方法在0.1%（W/W)时都能21），表16猪检测方法的相对检测限测试牛质量百分比（W/W，%）阳性结果百分比(%)5.02.00.10.0125.0%0.0010%QuantStudio5、ABIQuantStudio7分别对猪DNA样品（20n表17不同仪器型号对测试结果的影响仪器型号猪ABI7500+BioRadCFX96+++22表18不同反应体积对测试结果的影响反应体积(µL）猪+20+21+表19不同退火温度对测试结果的影响退火温度(℃)猪59+60+61+分别对猪DNA样品（20ng/μL)进行了测试，均能产生阳性结果（见表20）。表20不同引物探针浓度对测试结果的影响引物探针工作液浓度(μmol/L）加样体积(μL）猪上游引物1+上游引物1探针0.5上游引物0.85+上游引物0.85探针0.425Eiw0.7+上游引物0.7探针0.3523以上实验结果证明，所建立的猪源性成分的实时荧光PCR检测方法具有较好表21所示，表明这些方法适合精补饲料、浓表21实际饲料样品的检测猪1234567892425表22修订后标准和修订前标准检测结果比较样品检测项目本方法GB/T21101-2007是否一致种猪浓缩饲料+5%含量的猪肉骨粉猪源性成分++一致种猪浓缩饲料+1%含量的猪肉骨粉猪源性成分++一致2.6不同DNA提取方法对检测结果的影响比较肉骨粉、1%含量的猪肉骨粉等六个样品，分别使用修订后标准的方法和修订前一致见表23）。表23不同DNA提取方法对检测结果的影响比较序号名称猪DNA提取方法1DNA提取方法21种猪浓缩饲料+5%含量的猪肉骨粉2种猪浓缩饲料+1%含量的猪肉骨粉26实验室验证参考上海海关动植物与食品检验检疫技术中心在制订ISO标准ISO/TS20224-3:2020《Molecularmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-关动植物与食品检验检疫技术中心在制订ISO标准的过程中，对所建立的猪源在内的6个国家分两次进行国际协同实验，12个实验室参与，并对实验结果进行统计分析。验证所建立方法的准确性和适表24假阳性、假阴性率测试样品猪参加协同实验的实验室数量提交结果的实验室数量每个实验室收到的样品数量总样品数量含有检测靶序列的样品数量78不含检测靶序列的样品数量78假阳性结果的数量0假阳性率/%0假阴性结果的数量0假阴性率/%027LOD和POD验证：通过协同实验统计结果表明，样品浓度在1copy拷贝/PCR反应）时检出率为100%表25表明所建立的猪源性成分检测利用统计学软件对所建立的猪源性成分检测方法表25绝对检测限的协同实验结果分析靶序列拷贝数（拷贝/PCR反应）P/TP(%)2078/7878/78578/78272/7892.3149/7862.80.530/7838.50.17/789.0表26检出概率（POD）的协同实验结果参数猪实验室数量每个稀释水平的PCR重复数量6实验室间平均POD0.78实验室间平均POD的95%置信区间0.67-0.87相对于理想POD曲线（b=1）的斜率b实验室间相对标准偏差σL0.30理论中位数实验室的LOD95%（以拷贝/PCR反应表示）2024年7月，标准编制小组委托国家食品质量检验检测中心（上海）、长28本次修订的猪源性成分检测方法，由普通PCR+酶切+电泳改为实时荧光PCR检测方法，提高了方法的稳定性、重现性和再现性，提高饲料中猪源性成表27国内外实验室之间的样品检测结果比对（猪成分检测方法）1--+--++--+++2--+--++--+++3--+--++--+++4--+--++--+++5--+--++--+++296--+--++--+++7--+--++--+++8--+--++--+++9--+--++--+++--+--++--+++--+--++--+++--+--++--+++--+--++--+++本项目修改采用ISO/TS20224-3:2020MolecularbiomarkeranalysisDetectionPorcineDNAdetectionmethod分子生物标记分析30（2）发布后、实施前应将信息在媒体上广为宣传，建议全国饲料工业标准31[2]国家质量监督检验检疫总局.饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法:[5]国家质量监督检验检疫总局.食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法:[6]国家质量监督检验检疫总局.动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检[11]中华人民共和国农业部.转基因动物及其产品成分检测羊内标准基因定性PCR方法:农业部[13]国家质量监督检验检疫总局.动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法.GBT[14]国家质量监督检验检疫[15]中华人民共和国农业部.转基因动物及其产品成分检测猪内标准基因定性PCR方法:农[17]国家质量监督检验检疫总局.动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法PCR方法:32[23]ISO.Molecularbiomarkefeedstuffsbyreal-timePCR—Part1BovineDNAdetectionmet[24]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectionoffeedstuffsbyreal-timePCR—Part2OvineDNAdetectionmethod:ISO/TS20224-2:[25