35个与胰岛相关的转录因子基因型与2型糖尿病B细胞功能衰竭关系分析研究 临床医学专业

第1章引言1.1研究背景1.1.1糖尿病的流行病学研究特征及其现状2型糖尿病在世界范围内呈爆发式流行，根据国际糖尿病联盟IDF（http:://）最新数据：世界范围内8.4%成人患有糖尿病，总数近4.15亿，即每11个人中就有一个人是糖尿病患者，到2040年，全球6.42亿人患有糖尿病，即每10个人中就有一个人是糖尿病患者，并且有一半糖尿病患者未被诊断。而随着经济的发展和生活方式的改变，我国的糖尿病发病同样迅速增长。根据2010年的全国糖尿病流行病学调查，中国成年糖尿病患病率已达到11.6%，对比于2007-2008年的患病率9.7%上升了19.6%，而诊断为糖尿病的患者仅仅3.5%。患有糖尿病的患者中接受糖尿病治疗的仅为25.8%，以糖化血红蛋白＜7%为糖尿病患者血糖控制达标标准，达标率尚不足40%ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[1]，因此T2DM在目前的防止过程中面临着低诊断率、低治疗率和低达标率。而长期血糖控制不达标，随之而来的是大血管、微血管并发症，这些微血管、大血管并发症使患者面临肾衰、失明、截肢等，极大地降低患者的生活质量，甚至导致死亡，每6秒钟就有一个人死于糖尿病相关并发症（http:://），其中心血管事件仍然是糖尿病死亡的首要原因ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[3]。1.1.2β细胞功能衰竭在糖尿病发生和发展中的作用在糖尿病初发阶段,通常通过口服药物就能将血糖控制,而随着糖尿病病程的延长,即使采用多种口服药物也不能将血糖控制在目标以内,需要补充胰岛素,甚至胰岛素替代治疗,口服药物治疗失败最主要的原因是胰岛β细胞功能衰竭。英国糖尿病前瞻性性研究UKPDS表明，糖尿病发生时胰岛β细胞功能已下降50%,随着糖尿病病程的延长逐渐衰竭,在糖尿病诊断的5年内，β细胞功能下降25%，75%的患者在9年内单药治疗失败,血糖控制愈加困难ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[4]。多种因素参与糖尿病发生，包括遗传、增龄、肥胖、高血糖、高血脂代谢紊乱(糖脂毒性)等因素ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[5,6],他们多通过胰岛素抵抗和或β细胞功能障碍导致糖尿病。已知代谢紊乱在糖尿病发生后β细胞功能衰竭重发挥重要作用,但遗传因素是否与胰岛β细胞功能衰竭相关，仍然是一个有待研究的重要问题。1.1.3糖尿病致病基因的研究现状青少年发病的成年型糖尿病（MODY）MODY是一种单基因突变致病的特殊类型糖尿病，MODY的特征性临床表现包括（1）青年发病；（2）常染色体显性遗传；（3）β细胞功能缺陷但尚存有一定的胰岛功能；（4）无自身免疫或胰岛素抵抗的相关证据ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]。目前有13种MODY亚型，GCK、HNF1α和HNF4α最为常见ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8]。.1葡萄糖激酶（GCK）基因突变（MODY2）HNF1α是导致常染色体显性遗传的、有症状的、家族性糖尿病的最常见的致病基因，主要表达于胰腺β细胞、肝脏和肠道，与HNF-4α、HNF1β等共同调节葡萄糖转运子2(GLUT2)，NF1α突变影响胰腺β细胞发育，表现为成年早发糖尿病和进行性β细胞功能下降。研究证实HNF-1α突变的MODY患者对磺脲类药物的敏感性近乎T2DM患者的4倍，所以HNF1α突变所致的MODY患者首选小剂量磺脲类药物治疗ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[9]。因此，不同基因突变引起的MODY患者需要采取不同的治疗方式，使得患者最大获益。.2HNF4α突变（MODY1）和HNF1β突变（MODY5）HNF4α主要表达于肝脏、胰腺和肾脏，其杂合突变所致的MODY1类似于与HNF1α突变所致的的MODY3，由于HNF4α不仅调控β细胞发育和胰岛素分泌，在糖脂代谢中同样起重要作用，所以HNF4α突变的MODY患者常伴有脂代谢异常，治疗上同样首选小剂量磺脲类药物。HNF1β调控胰腺早期发育，其突变可导致胰腺萎缩和胰岛素分泌不足，导致MODY5。HNF1β同样调控肾脏发育，HNF1β基因突变患者不仅表现为糖代谢异常，几乎都伴有肾脏发育异常。ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10]MODY5患者对磺脲类药物敏感性差，需早期起始胰岛素治疗。新生儿糖尿病（NDM）NDM是一种异质性单基因遗传病，顾名思义，NDM多在出生6月内发病，至今已发现了22种不同的NDM临床亚型，最常见原因是编码ATP敏感性钾离子通道亚单位相关基因突变，最常见的是ABCC8基因、KCNJ11基因，约占40%。ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[7]幸运的是ABCC8基因、KCNJ11基因突变导致的NDM患者对磺脲类药物治疗较为敏感，所以这40%的NDM可以转换为口服磺脲类药物控制血糖。ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[11]1.1.4糖尿病易感基因的研究上述基因突变导致的糖尿病只占少数ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12]，而更多的位点变异并不会直接导致β细胞功能缺陷，但影响了β细胞的功能。基于全基因外显子测序技术的发展，发现位于HNF1α基因一个少见的错义突变(c.1552G→A,pE508K)，通过比较1443例有糖尿病的患者和1673无糖尿病患者，该变异的频率分别是2.1%和0.36%，OR值达5.48，由此发现(c.1552G→A,pE508K)是拉丁裔T2DM患者的一个易感基因ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[13]。功能试验也表明，这种错义突变可导致其调节的靶基因启动子转录活性降低，只是没有致病突变导致的转录或降低那么严重。这个研究证实了遗传学界的一个假说“commonvariants，lowrisk”，“rarevariants，highrisk”，同样提示易感基因调节转录因子转录活性的高低影响β细胞功能。15-20图4HNF-1α不同部位突变导致转录活性改变的严重程度与糖尿病表型因此，我们提出假设：其他与β细胞功能密切相关的基因是否也存在类似HNF-1α一些低频率和高风险的基因？这些基因是否存在一些突变在β细胞衰竭发挥作用?这是一个仍待探索的问题。1.1.5糖尿病患者糖脂毒性的研究高血糖和高血脂在糖尿病发病机制在β细胞功能衰竭中的作用已有广泛和深入的研究。糖尿病早期胰岛素强化治疗降低血糖的机制也被认为与延缓或逆转糖毒性引发的β细胞功能衰竭有关9。糖脂毒性引起氧化应激和内质网应激被认为是糖尿病最主要的发病机制。他们可以抑制胰岛β细胞增殖、胰岛素合成减少或分泌障碍，近来研究发现代谢异常也可能导致β细胞去分化ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21-22]。研究发现，脂肪酸可导致多个基因表达的改变ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[23-25]。脂肪酸诱导脂肪氧化基因的表达，却抑制糖代谢基因的表达。这种基因表达谱的改变可能导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降。同时,脂肪酸还可导致胰岛素受体底物-2表达的下降。在高糖同时存在时,脂肪酸抑制β细胞增殖的作用更加明显。糖脂毒性的发生与内质网应激有关。我们利用大鼠的胰岛β细胞系INS-1细胞研究发现，糖毒性和糖脂毒性造成β细胞功能衰竭。研究发现内质网应激模型，包括糖毒性、糖脂毒性和毒胡萝卜素都可以导致MODY通道上的基因表达改变。同时，利用二氮嗪、GLP-1、化学伴侣分子4-苯基丁酸钠盐(PBA)则阻止相关基因的下调。在各种不同因素导致的内质网应激模型中，一个共同的基因改变就是Nkx6.1和MNx1的改变。糖毒性、脂毒性和毒胡萝卜素导致其表达显著下降，而二氮嗪、PBA和GLP-1能够防止该基因表达的下调。Nkx6.1是在多个组织表达的转录因子NKx6.1对从内分泌前体细胞分化为产生胰岛素的细胞是充分和必要的，还是决定胰岛α细胞分化的转录因子Arx的抑制子，NKx6.1基因突变后可导致胰岛细胞向α细胞转变ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[26]。1.1.5转录因子在β细胞发生、分化、增殖及分泌胰岛素中的作用引用综述的所有文献通过基因和环境对β细胞功能的研究，发现转录因子表达对β细胞发育、生成及分泌胰岛素极其重要，首先我们来回顾一下β细胞产生胰岛素的过程：首先在β细胞核内初始生成前胰岛素原mRNA，头部加5’甲基鸟嘌呤帽、尾部加聚腺苷尾，切除内含子后，形成成熟的前胰岛素原mRNA，成熟mRNA随之转移入内质网，结合到内质网膜上的核糖体上进行蛋白翻译，合成含有110个氨基酸残基，分子量11.5kDa的前胰岛素原，前胰岛素原由胰岛素原（PI）和位于端含24个氨基酸残基的信号肽两部分组成，信号肽酶切掉信号肽，形成9KDa的PI，PI经过内切酶、羧基肽酶H转变为胰岛素分子量为6KDa的胰岛素释放入血，信号肽在粗面内质网内降解，成熟的胰岛素包含21氨基酸的A链和30个氨基酸的B链。而在胰岛素基因前有一基因启动子区调控元件，转录因子和启动子特定区域结合启动胰岛素基因的表达，如PDX1属于含有同源域蛋白家族，和启动子区域的A3结合；NeuroD1——MODY6bHLH蛋白家族，与E1结合；MafA属于bZIP蛋白家族，与C1结合（如图1）。上述转录因子通过和与胰岛素基因启动子元件特意结合，调节胰岛素基因的转录。转录因子不仅和胰岛β细胞内的特异性转录因子与该启动子区域特异性结合调节胰岛素基因的转录，还在胰腺发育、胰岛β细胞分化等过程中也起着重要作用。转录因子调控胰腺发育在人类胚胎发育的第4周，衍生于内胚层的胰腺背侧和腹侧外翻，形成背胰芽和腹胰芽，胰芽生长形成胰腺的各级导管。胚胎发育第5周晚期，背胰芽生长，向背侧延伸，腹胰绕着肠管，朝着背胰的方向，向背侧延伸，胚胎发育的第7周晚期，背胰芽和腹胰芽合并为一完整的胰腺，背胰芽形成胰头、全部胰体和胰尾ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]。Isl-1存在于各种胰岛细胞中，对于胚胎发育过程中胰岛的形成至关重要。MNX1转录因子Hb9是背胰形成所必须的，LIM同源结构域蛋白1（ISL1）是仅在背胰周围的间充质产生，腹胰中不表达，随后背胰和腹胰产生不同的内分泌细胞，背胰主要发育成分泌胰岛素和胰高血糖素的胰岛，由82%β细胞、13%a细胞、4%r细胞和1%的PP细胞组成。腹胰主要发育成外分泌的腺泡组织及较小散在分布的胰岛，由79%PP细胞、18%β细胞、2%？细胞和1%的a细胞组成ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>31</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>31</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1495451474">31</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><QuantitationofEndocrineCellContentinthePancreasofNondiabeticandDiabeticHumans.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[28]。胰腺祖细胞在E9.5被胰十二指肠同源盒基因1（PDX1）所标记，PDX1是生长所必须的，大约在E13.0腺泡和导管上皮细胞的PDX1基因表达下调，但在内分泌细胞中维持，在β细胞中表达上调，这种表达差异贯穿整个生命始终。胰腺转录因子1α（PTF1α）从在胰腺发育的E9.5开始表达，胰芽整个生长的过程中也是必须的，随后在导管和内分泌细胞中表达下调，但是在腺泡细胞中持续表达。转录因子调控β细胞分化β细胞分化需要在适当的时间和序列转录因子的动态改变。E9.5-13.5胰高血糖素细胞、胰岛素细胞，和两者都能分泌的细胞，这些细胞出现短暂高峰，但是谱系追踪研究现实这些细胞不能形成成熟的胰岛。从E13.5到产生成熟胰岛的内分泌细胞，并且依赖PDX1、HNF6、Hgn3，Ngn3还可以诱导必要的转录因子表达的增加，如神经分化表达基因1（NeuroD1），和配对盒基因4（PAX4）。PAX4配对盒基因4（PAX4）基因敲除抑制β或δ细胞编程，而广泛表达的brn4抑制α细胞的发育，但β和δ细胞的发育不受影响ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>10</RecNum><DisplayText>[4]</DisplayText><record><rec-number>10</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1494663997">10</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><RegulationofInsulinSynthesisandSecretionandPancreaticBeta-CellDysfunctioninDiabetes.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[29]。转录因子调控β细胞分泌胰岛素胰岛素基因：胰岛素基因包含3个外显子和2个内含子，除了啮齿类动物有两个非等位胰岛素基因，大多数动物的胰岛素基因只有1个，人类唯一的胰岛素基因位于2号染色体的2p21位点上，在络氨酸羟化酶TH基因和胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因之间，转录起始位点的上游序列由胰岛素基因启动子构成。哺乳动物的胰岛素基因中，TSS序列位于−350bp，其控制胰岛素的细胞类型的特异性表达，大多数转录调控发生在这些保守序列内的相互作用。研究表明，−340和91之间的序列是主要的胰岛素基因的转录增强子区域，增强子区域包括ACE元件，它决定了细胞的特异性与葡萄糖调节胰岛素基因的表达，离散序列元件A、C、E、Z和CRE因子在胰岛素基因启动子区内，决定胰岛素在β细胞内的定位，并作为β细胞转录因子调节胰岛素基因表达的结合位点。转录因子结合位点位于400-碱基对的区域内，相对于TSS是胰岛素β细胞特异性表达的决定因素ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Hay</Author><Year>2006</Year><RecNum>37</RecNum><DisplayText>[5]</DisplayText><record><rec-number>37</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496234576">37</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Hay,C.W.</author><author>Docherty,K.</author></authors></contributors><auth-address>SchoolofMedicalSciences,UniversityofAberdeen,InstituteofMedicalSciences,Aberdeen,AB252ZD,UK.</auth-address><titles><title>Comparativeanalysisofinsulingenepromoters:implicationsfordiabetesresearch</title><secondary-title>Diabetes</secondary-title></titles><periodical><full-title>Diabetes</full-title></periodical><pages>3201-13</pages><volume>55</volume><number>12</number><keywords><keyword>Animals</keyword><keyword>BaseSequence</keyword><keyword>DiabetesMellitus/*genetics</keyword><keyword>GeneExpressionRegulation</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Insulin/*genetics</keyword><keyword>Mammals</keyword><keyword>Phylogeny</keyword><keyword>*PromoterRegions,Genetic</keyword><keyword>Rodentia</keyword><keyword>Transcription,Genetic</keyword></keywords><dates><year>2006</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>0012-1797(Print) 0012-1797(Linking)</isbn><accession-num>17130462</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/17130462</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.2337/db06-0788</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[30]。许多顺式和反转录因子与胰岛素增强子区域的激活有关。在所有特征胰岛素增强序列的A，C和E元素包含在核心结合基序ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>38</RecNum><DisplayText>[6]</DisplayText><record><rec-number>38</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496234834">38</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title>STRUCTUREANDEVOLUTIONOFTHEINSULINGENE</title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[31]。A元件是定位于胰岛素基因控制区的保守序列的一段富含A/T序列ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>36</RecNum><DisplayText>[7]</DisplayText><record><rec-number>36</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496234452">36</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><50TheInsulinGenePromoterASimplifiedNomenclature.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[32]，其有一个ATTA核心，是同源蛋白识别结合的序列，包括(PDX-1)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>39</RecNum><DisplayText>[8-10]</DisplayText><record><rec-number>39</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496235004">39</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><55IPF1,ahomeodomain-containingtransactivatoroftheinsulingene.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><RecNum>40</RecNum><record><rec-number>40</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496235190">40</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><56CharacterizationofSomatostatinTransactivatingFactor-l,aNovelHomeoboxFactorThatStimulatesSomatostatinExpressionPancreaticIsletCells.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><RecNum>41</RecNum><record><rec-number>41</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496235198">41</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><57IDX-1-anewhomeodomaintranscriptionfactorexpressedinratpancreaticisletsandduodenumthattransactivatesthesomatostatingene.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[33]。Isl-1存在于各种胰岛细胞中，对于胚胎发育过程中胰岛的形成至关重要。胰岛素启动区有两个C元件。C1位于小鼠胰岛素TSS上游的118-107bp，由大鼠胰岛素启动子元件3b（RIPE3b）和RIPE3b2组成。RIPE3b1DNA结合MafA，MafA仅在β细胞中表达，介导葡萄糖调节的胰岛素表达和脂肪酸抑制的胰岛素表达。当胰岛长期暴露于高糖和脂肪酸时，就通过削减细胞核MafA基因的表达来抑制胰岛素基因的转录ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[34]。C2元件，位于大鼠基因的-317/-311bp，被认为是胰腺胰岛细胞增强子PISCES。C2元件分别在aβε细胞的胰岛素、胰高血糖素、生长抑素转录过程中发挥作用。PISCES是PAX6的结合位点，PAX6是胰岛发育和胰岛素基因转录必不可少的。E元件（5′-GCCATCTG-3′）是胰岛素增强子中的两个独立的迷你增强子ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><RecNum>50</RecNum><DisplayText>[18]</DisplayText><record><rec-number>50</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496239537">50</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors></contributors><titles><title><71Cell-specificandUbiquitousFactorsAreResponsiblefortheEnhancerActivityoftheRatInsulinI1Gene*.pdf></title></titles><dates></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[35]。该序列5′-GCCATCTG-3′被很多决定细胞类型的转录因子共享，例如肌原细胞,Myf-5,成肌素,可使多潜能中胚层细胞转变为成肌细胞。Z元件是人类胰岛素特有的位于A元件（−292to−243bp）上游的序列，PDX-1和MafA通过激活Z元件调节胰岛素基因的转录ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pino</Author><Year>2005</Year><RecNum>72</RecNum><DisplayText>[32]</DisplayText><record><rec-number>72</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="2xa502f220eat8e9pahpfdessxx9exxspa5d"timestamp="1496589441">72</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pino,M.F.</author><author>Ye,D.Z.</author><author>Linning,K.D.</author><author>Green,C.D.</author><author>Wicksteed,B.</author><author>Poitout,V.</author><author>Olson,L.K.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofPhysiology,MichiganStateUniversity,3176BiomedicalandPhysic