生物化学检验实验指导与练习

生物化学检验实验指导

张申编写

怀化医专医学检验系生化数研室

目录

第一章生物化学检验实验室基本知识

实验一刻度吸量管的容积检定

实验二酸碱标准溶液的配制与浓度校正

实验三721型分光光度计波长检测与校正

实验四回收试验

第二章血清（浆）蛋白质测定

实验五血清总蛋白测定（双缩胭法）

实验六血清清蛋白测定（溟甲酚绿法）

实验七血浆纤维蛋白原测定（双缩版法）

实验八血清粘蛋白测定（酚试剂法）

实验九血清蛋白质测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）

第三章体液葡萄糖及其代谢物测定

实验十血糖测定（GOD-POD法）

实验十•糖化血红蛋白测定（亲和层析法）

第四章血清（浆）脂类及脂蛋白测定

实验十二血清总胆固醇测定（胆固醇氧化酶法）

实验十三血清高密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）

实验十四血清低密度脂蛋白胆固醇测定（化学修饰酶法）

实验十五血清甘油三酯测定（GPO-PAP法）

实验十六血清脂蛋白测定（琼脂糖电泳法）

实验十七载脂蛋白测定（免疫比浊法）

第五章常用酶类测定

实验十八血清丙氨酸氨基转移酶测定（赖氏法）

实验十九血清丙氨酸氨基转移酶测定（速率法）

实验二十血清乳酸脱氢酶测定（比色法）

实验二H■•一血清乳酸脱氢酶测定（速率法）

实验二十二血清淀粉酶测定（碘淀粉比色法）

实验二十三血清碱性磷酸酶测定（氨基安替比林比色法）

实验二十四血清碱性磷酸酶测定（速率法）

实验二十五血清Y-L-谷氨酰基转移酶测定（重氮比色法）

实验二十六血清Y-L-谷氨酰基转移酶测定（速率法）

实验二十七血清肌酸激酶测定（肌酸显色法）

实验二十八血清肌酸激酶测定（速率法）

实验二十九血清脂肪酶测定（速率法）

实验三十血清乳酸脱氧酶同工酶测定（琼脂糖电泳法）

实验三十一血清肌酸激酶同工酶测定（琼脂糖电泳法）

第六章血清无机离子及微量元素测定

实验三十二血清钾、钠离子测定（火焰光度法）

实验三十三血清钾、钠、氯、钙离子测定（离子选择电极法）

实验三十四血清总钙测定（EDTA滴定法）

实验三十五血清氯离子测定（硝酸汞滴定法）

实验三十六血清无机磷测定（磷铝酸法）

实验三十七血清铁与总铁结合力测定（亚铁嗪法）

第七章血气分析

实验三十八血浆碳酸氢盐测定（酸碱滴定法）

实验三十九血液pH、PO2、PCO2测定（血气酸碱分析仪）

第八章肝功能试验

实验四十血清胆红素测定（改良J-G法）

实验四十一血氨测定（碱性酚次氯酸盐法）

实验四十二血氨测定（速率法）

实验四十三血清总胆汁酸测定（3-a羟类固醇脱氢酶法）

第九章肾功能试验

实验四十四血清尿素测定（二乙酰一眄法）

实验四十五血清尿素测定（酶偶联速率法）

实验四十六血清肌酊测定（碱性苦味酸法）

实验四十七血清尿酸测定（磷鸨酸还原法）

实验四十八血.清尿酸测定（尿酸酶-过氧化物酶偶联法）

第十章激素及代谢产物测定

实验四十九血清（尿）人绒毛膜促性腺激素测定（ELISA法）

第一章生物化学检验实验室基本知识

实验一刻度吸量管的容积检定

【实验要求】

学习称重法检定刻度吸量管容积的实验方法。每位学生检定一支刻度吸量管的容积，并

评价该刻度吸量管的等级。

【实验原理】

以祛码重量为基准，精确称量某规格吸量管标示量物质（蒸储水）的重量，再根据温度

系数校正实际容量，由实际容量和标示容量之差评价检定刻度吸量管的等级。

【器材】

1.刻度吸量管规格为1ml至10ml数支。

2.1/10000分析天平

3.称量瓶

4.温度计

【操作】

1.调整分析天平零点。

2.粗称称量瓶，再用分析天平准确称其重量。

3.用刻度吸量管吸蒸储水至刻度，随即放入称量瓶内，用分析天平准确称重。

4.测量蒸储水水温。

5.根据称重结果与水温，利用所学公式计算刻度吸量管的实际容量。

【结果】

根据刻度吸量管的标示容量与实际容量，评定该刻度吸量管的等级。

实验二酸碱标准溶液的配制与浓度校正

【实验要求】

要求学会正确使用微量加样器、刻度吸量管和容量瓶，配制10mmol/LHCl标准溶液和

lOmmol/LNaOH标准溶液，并校正浓度。掌握手持刻度吸量管的滴定过程与终点颜色的变

化。

【试剂】

l.lmol/LHCl溶液实验前经准确标定。

2.1mol/LNaOH溶液实验前经准确标定。

3.酚红指示剂称取酚红20ing,加10mmol/LNaOH溶液5.64ml,研磨溶解后加生理盐

水至100mL

4.154mmol/LNaCl溶液（生理盐水）pH=7.0。

【操作】

（-）标准溶液的配制

1.10mmol/LHCl溶液用微量加样器准确吸取已精确标定的1mol/LHCl溶液1ml,移

至100ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。用试剂瓶密闭保存。

2.1（）mmol/LNaOH溶液用微量加样器准确吸取已精确标定的1mol/LNaOH溶液1ml,

移至100ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度。用塑料试剂瓶密闭保存。

（-）标准溶液浓度的校正

如果上述酸碱溶液在阿•实验中都作为标准液使用，两者浓度应相等，两者浓度是否相

等可用如下试验校正。

取中号试管1支，用微量加样器加稀释酚红溶液0.1ml,用刻度吸量管吸加10mmol/LHCl

溶液1.0ml,中性生理盐水2.0ml,混匀，用10mmol/LNaOH溶液滴定至微红色（15s不褪

色），记录NaOH溶液的消耗体积。平行操作2管，取NaOH溶液消耗体积的平均值。如果

NaOH溶液恰好消耗1.0ml则表示两溶液浓度相等。假如不等，则要计算校正系数。

例如：滴定时用去NaOH溶液1.1ml,则校正系数为：

1/1.1=0.9

滴定时用去NaOH溶液0.9ml,则校正系数为：

1/0.9=1.1

实验三721型分光光度计波长检测与校正

【实验要求】

学习721型分光光度计的使用方法与吸收曲线绘制及波长校正方法。

【实验原理】

光源通过棱镜色散成连续光谱,转动准直镜使色散光谱中某一部分由出光狭缝射出而成

一单色光束，该光束的主波长由随同准直镜转动的波长刻度盘指示。实际主波长与波长刻度

盘指示允许有一定误差（360〜600nm范围土3nm,600〜700nm范围±5nm,700-800nm

范围土8nm）。刻度盘读数与出射光束实际波长是否相符，可通过测绘已知吸收峰波长的标

准溶液或标准滤光片（如错被滤光片）的吸收曲线而确定。

错被滤光片在529nm有吸收峰（Xmax）。以错钛滤光片在520〜540nm范围的吸光度

对波长作吸收曲线（A-入）。如果吸收曲线的吸收峰偏离529±2nm（超过允许误差波长）

时应进行波长校正。

【器材】

721分光光度计，分光光度计配件——错被滤光片、滤光片支架，白卡纸，螺丝刀，坐

标纸。

一、吸收曲线绘制

【操作】

1.接通仪器电源，预热20min。

2待仪器稳定后将错锁滤光片（水红色）固定于滤光片支架，置于比色皿座上。转动波

长调节旋钮，使波长刻度盘读数为520nm,以空气调零、调“T”旋钮至100%,将错钛滤

光片推向光路并记录吸光度值（每一波长重复测定3次。

3.按表1-1中各波长，重复上述步骤（每次均须重新调零和调100%）,记录数据。

表1-1不同波长处错数滤片的吸光度

入/nmAA./nm

A\A2A3A|A?A3A

520532

522534

524536

526538

528540

530—

【结果处理】

1.取方格坐标纸，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标（每一•小格为0.01A）建立直角坐

标。

2.将不同波长处测得吸光度的平均值（入）按相应波长在坐标纸上标出。

3.连接各点，即可得到所测标准滤光片的吸收曲线。

4.观察指定吸收峰波长（实测值）与标度值是否相符，若不符合，即两者存在偏差。偏

差值在±2nm以内，波长误差在允许误差范围；偏差的绝对值＞2nm（超过允许误差），则

应进行波长校正。

二、波长校正

【操作】

1.接通仪器电源，预热20min；

2.将错铉滤光片固定于滤光片支架，置于比色皿座内，旋转波长至528（或530）nm处，

以空气调零、调“T”旋钮至100%；

3.用螺丝刀卸下仪器侧面板上的四颗固定螺丝，按说明书指示找准波长调节螺杆；

4.手握螺丝刀，缓慢转动波长调节螺杆，同时观察读数表盘上吸光度变化（吸光度下降

应反向转动）直至调至最大（透光度则为最小）为止；

5.读取特征波长附近各10nm（间隔2nm测定•次）的吸光度值验证无误后，上好侧面

板。

【注意事项】

1.调节前务必确认波长螺杆是否找准，且不可错调，以免引起更大的麻烦。

2.调节波长螺杆时用力要均匀，转动要缓慢，用力过猛，可导致螺杆头损坏。

3.分光光度计波长检定属计量部门定期强制检定项目，各实验室应接受当地计量部门检

定，并保留检定合格证书备查。

实验四回收试验

【实验原理】

将被测物标准液加入待测标本中作为回收样品，原待测标本中加入等量的无被测物的溶

剂作为基础样品,然后同时用候选方法对两样品进行测定，通过以下公式计算出回收率。

加入浓度=标准液浓度x由后上准警曾/一荷

待测标本量（血）+标准液量（初）

回收浓度=回收样品测得浓度一基础样品测得浓度

回收率（％）=暨需X100

加入浓度

【试剂】

1.血清标本收集无肝炎病毒、无溶血、无脂浊的人混合血清。

2.葡萄糖标准液25mmol/L、50mmol/L（＞

3.GOD-POD法测血糖试剂盒。

【操作】

1.样品准备基础样品：血清2ml+蒸储水0.1ml

回收样品I：血清2ml+25mmol/L葡萄糖标准液0.1ml

回收样品II：血清2ml+50mmol/L葡萄糖标准液0.1ml

2.血糖浓度测定按GOD-POD法测定各制备样品的血糖浓度。

3.将各计算结果填入下表。

表1-2回收试验的数据处理

测得浓度（mmol/L）加入浓度（mmol/L）回收浓度（mmol/L）回收率/%

基础样品

回收样品I

回收样品H

平均回收率

【注意事项】

1.吸量要准确，否则将严重影响实验结果。

2.加入的标准液体积要小，一般不超过待测标本体积的10%,否则血清基质被过分稀释，

不能反映原有标本的实际情况。

3.•般须做高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率；且加入标准液后，

样品中被测物浓度最好达到医学决定水平。

4.每份样品应重复测定2〜3次，以减少随机误差对实验结果的干扰。

5.为防止标准液不稳定、制备中的误差或实验操作等因素影响实验结果，可用比较方法

对样品进行同步分析，增加实验结果的可靠性。

【结果判断】

一般实验方法回收率应为95%〜105%。

第二章血清（浆）蛋白质测定

实验五血清总蛋白测定（双缩胭法）

血清总蛋白（totalprotein,TP）是血清中所有蛋白质的总称。TP的测定方法很多，常

规化学测定方法是双缩服法。

【实验要求】

掌握双缩胭法测定血清TP的实验原理与方法;练习比色法的结果计算及标准曲线制作;

巩固分光光度计的使用。

【实验原理】

蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中与Cr十作用生成稳定的紫红色络合物。颜色深浅在

一定范围内与蛋白质含量成正比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计算或查标准曲线即可

求出血清总蛋白含量。

【试剂】

L6mol/L氢氧化钠溶液称取NaOH240g,用新鲜蒸储水溶解并最终定容至1L,置室

温贮存在密封的聚乙烯瓶里。

2.双缩胭试剂（Doumas）称取结晶硫酸铜（CuSO「5H2。）3.0g,溶于500ml新鲜蒸

储水中，加酒石酸钾钠（NaKC4HQ,•4比0）9.0g,碘化钾（KI）5.0g,待完全溶解后，加

入6moi/L氢氧化钠溶液100ml,最后用蒸播水定容至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，

可稳定6个月。

3.蛋白标准液多用商品血清蛋白标准液，或定标质控物为标准。

4.生理盐水（154mmol/L氯化钠）。

【操作】

取试管三支，标明测定、标准和空白管，按表4-4操作。

表2-1双缩胭法测定血清总蛋白操作表

加入物/ml测定管标准管空白管

待测血清0.1——

蛋白标准液—0.1—

生理盐水0.40.40.5

双缩胭试剂3.03.03.0

混匀，置37℃水浴lOmin（或25℃30min）,用540nm波长比色，以空白管调零，读取

各管吸光度。

【计算】

A

血清TP（g/L）=」x蛋白标准液浓度g/L

As

【标准曲线绘制】

1.配制20g/L蛋白标准液如蛋白标准液浓度为70g/L,则取此液2ml,加入生理盐水

5ml,混匀即成。

2.取试管六支，标明管号，按表4-5操作。

表2-2双缩麻法测定血清蛋白标准曲线制作表

加入物/ml012345

20g/L蛋白标准液—0.10.20.30.40.5

生理盐水0.50.40.30.20.1—

双缩服试剂3.03.03.03.03.03.0

相当于血清蛋白质/g/L020406080100

混匀，置37℃水浴lOmin（25℃3Omin）,用540nm波长比色，以“0”管调零，读取

各管吸光度。上述操作应平行测定3次。各管取3次吸光度均值作为纵坐标，相应的浓度作

为横坐标，绘制成标准曲线。

【注意事项】

1.血清标本以新鲜为宜；明显溶血标本可干扰双缩胭反应，不宜使用：黄疸血清应做相

应血清空白；含脂类极多的血清加入试剂后仍混浊不清，可用乙醛抽提后再比色。

2.蛋白标准液要求澄清。不可选用未知性能的蛋白质作为血清蛋白测定的标准。

3.双缩胭试剂要密闭贮存，防止吸收二氧化碳；双缩版试剂中二价铜离子容易还原成一

价铜，故不宜长期保存。

4.右旋糖醉对测定有干扰，若患者注射右旋糖酢后，应过儿天之后再行测定。

5.血清蛋白质的含量一般用g/L表示，不用mol/L表示。

【参考范围】

60-80g/L1,

【临床意义】

1.血清总蛋白增高

（1）血液浓缩如呕吐、腹泻、高热等，外伤性休克，慢性肾上腺皮质功能减退（由

于钠的丢失而致继发性失水）。

（2）血浆蛋白质合成增加如多发性骨髓瘤。

2.血清总蛋白降低

（1）血浆稀释如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。

（2）营养不良和消耗增加如长期食入蛋白含量不足或慢性肠道疾病引起吸收不良，

使体内缺乏合成蛋白质的原料：消耗性疾病，如严重结核病、甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等。

（3）合成障碍当肝功能严重受损时，血浆蛋白质合成量减少，以清蛋白最为显著。

（4）蛋白质大量丢失严重烫伤、大出血、肾病综合征、溃疡性结肠炎。

【方法评价】

1.双缩服法并非蛋白质特有的颜色反应，凡含有两个或两个以上肽键的物质均能发生双

缩服反应。

2.双缩胭法呈色稳定，30min-4h内颜色不变；操作简便、快速，试剂稳定。不仅适合

手工操作，也便于上机分析。

3.线性范围为0~140g/L,RCV为4%o

实验六血清清蛋白测定（溟甲酚绿法）

清蛋白（albumin,Alb或A）由肝细胞合成，是血浆中含量最多的蛋白质。目前，国内

外实验室多采用在不分离清蛋白和球蛋白的条件下，用溟甲酚绿直接测定清蛋白的方法。

【实验要求】

掌握BCG法测定血清Alb的实验原理与方法；学习微量加样器的使用方法；能熟练使

用分光光度计。

【实验原理】

在pH4.2的缓冲液中，清蛋白作为一种阳离子与阴离子染料浪甲酚绿（bromocresol

green,BCG）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，颜色深浅与清蛋白含量

成正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，可求得血清清蛋白含量。

【试剂】

1.0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH4.1）称取氢氧化钠10g,琥珀酸56g,W于800ml

蒸偏水中，用lmol/L氢氧化钠溶液调pH至4』±0.05,加蒸馈水至1L,置40c冰箱低温保

存。

2.BCG贮存液（10mmol/L）称取澳甲酚绿（MW720.02）L80g,希5ml浓度为lmmol/L

氢氧化钠溶液中，加蒸储水至250ml,置棕色瓶保存。

3.叠氮钠贮存液溶解叠氮钠40g于1L蒸储水中。

4.聚氧乙烯月桂酸（Brij-35）溶液称取聚氧乙烯月桂酸25g,加蒸储水80ml,置60℃

左右水浴中使其溶解，加蒸储水至100ml。

5.BCG试剂于1L容量瓶内加入蒸镯水400mL琥珀酸缓冲贮存液100mL准确加入

BCG贮存液8ml,再加入叠氮钠贮存液2.5ml,聚氧乙烯月桂醴溶液2.5mL最后，用蒸储

水稀释至刻度。配好的BCG试剂的pH应为4.15±0.05»

6.清蛋白标准液（40g/L）多用商品血清蛋白标准，或定标质控物。此液冰箱保存。

7.生理盐水。

【操作】

取试管三支，标明测定、标准和空白管，按表4-6操作。

表2-3BCG法测定血清清蛋白操作表

加入物/ml测定管标准管空白管

待测血清0.02——

清蛋白标准液/g/L—0.02一

生理盐水——0.02

BCG试剂4.04.04.0

充分混匀，置室温10min,用630nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度。

【计算】

A

血清清蛋白（g/L）=4x清蛋白标准液浓度g/L

As

同时测定血清清蛋白与总蛋白，以总蛋白浓度减去清蛋白浓度，即得球蛋白（G）浓度,

并计算清蛋白与球蛋白比值（A/GI；值）。

【参考范围】

清蛋白：35〜55g/L球蛋白：20〜29g/LA/G：1.5-2.5/1

【临床意义】

1.血清清蛋白

（1）增高常见于严重脱水所致的血浆浓缩。

（2）降低临床上较常见，与总蛋白降低的原因大致相同。急性降低常见，大量出血

或严重烧伤；慢性降低见于肾病蛋白尿、肝功受损、肠道肿瘤与结核、慢性出血、营养不良

和消耗性疾病等。清蛋白如低于20g/L,患者可出现水肿。

2.血清球蛋白

（1）增高严重脱水、炎症、免疫系统疾病和肿瘤。

（2）降低血液稀释、严重营养不良、胃肠道疾病等。肾上腺皮质激素和其它免疫抑

制剂有抑制免疫功能的作用，会导致球蛋白合成减少。球蛋白浓度如低于10g/L时，可怀疑

为无丫球蛋白血症。

3.清蛋白与球蛋白比值（A/G）临床上常用A/G值衡量肝病的严重程度,当A/G值小

于1时，称比值倒置，为慢性肝炎或肝硬化的特征之一。

【方法评价】

1.高胆红素血症和溶血标本对本法不产生干扰。严重高脂血症可使结果偏高，应采用标

本空白校正。若标本混浊，可做标本空白（血清0.02ml,加琥珀酸缓冲液4ml）,用测定管

吸光度减去标本空白管吸光度后再计算结果。

2.BCG系一种pH指示剂，它受酸、碱影响较大，所用器材必须清洁，无酸、碱污染。

3.BCG试剂的pH必须严格控制在pH4.15±0.05,pH升高可使染料空白增高，与清蛋

白结合率下降。所以，控制反应液的pH是本法测定的关键。

4.BCG与蛋白质结合的特异性较低。它不仅与清蛋白结合呈色，还与血清中其它蛋白

质呈色，其中以a1球蛋白、运铁蛋白（属B球蛋白）、触珠蛋白（属a2球蛋白）最为明显，

BCG与不同蛋白质的反应速率不同，与清蛋白可立即发生反应（快反应），与其它蛋白质反

应较慢（慢反应）。实验证明，血清与BCG试剂一经混合，“慢反应”即可发生，约持续lh

才完成。

5.Brij-35是一种非离子去垢剂，它可增强BCG-清蛋白复合物的溶解度，消除BCG同

清蛋白反应时可能产生的沉淀，它的浓度高于或低于所指定的浓度时，均导致敏感度降低和

直线性丧失，对测定结果有较大影响。故其配制浓度和所加试剂量一定要准确。

6.当60g/L清蛋白标准液与BCG试剂作用后，溶液在光径1cm、波长630nm时，测定

的吸光度应为0.811±0.035,若达不到此值，表示BCG试剂灵敏度较差。

7.本法灵敏度高，操作简便，重复性好，并可用于自动化分析技术。

8.线性范围为10〜60g/L，CV<3%,

实验七血浆纤维蛋白原测定（双缩服法）

纤维蛋白原（Fibrinogen,Fbg）是血液中含量最高的凝血因子。测定方法有凝固法、免

疫比浊法、复钙双缩胭法等。本章介绍复钙双缩胭法。

【实验要求】

掌握双缩版比色法测定血浆纤维蛋白原的实验原理与方法：学会比色法计算公式的推

导。逐步养成严谨务实的良好工作作风。

【实验原理】

在稀释血浆中加入钙离子，使纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块，分离并洗涤沉淀后，

用双缩胭法测定其含量。

【试剂】

1.225.2mmol/L氯化钙溶液称取氯化钙25g,用蒸储水溶解并定容至1L。

2.生理盐水

3.双缩胭试剂

4.蛋白标准液（试剂2、3、4同血清总蛋白测定）。

【操作】

1.测定管制备

(1)在25ml小烧杯中加入新鲜血浆0.5ml,生理盐水10ml,225.2mmol/L氯化钙溶液

0.5ml,混匀。置37℃温箱保温，直至凝块形成(大约需30min)。如纤维蛋白原含量过低，

需延长保温时间，对无纤维蛋白凝块形成的标本，需保温过夜后方可作结论。

(2)用一小玻棒小心将凝块卷起，转动玻棒并在杯壁挤压，使凝块紧裹在玻棒上，取

出，用滤纸小心吸干，用蒸储水小心冲洗数次。

(3)将裹有凝块的玻棒放入一试管中，此即为测定管。

2.另取试管两支，标明标准管和空白管，按表4-7进行操作。

表2-4双缩崛法测定血浆纤维蛋白原操作表

加入物/ml测定管标准管空白管

步骤1制得的凝块全部——

生理盐水0.10.1

玻棒搅动直至凝块完全溶解

1:1()稀释的蛋白标准液一0.1一

双缩胭试剂5.05.05.0

混匀，置37℃水浴lOmin(或25℃30min),用540nm波长比色，以空白管调零，读取

各管吸光度。

【计算】

血浆纤维蛋白原(g/L)='X蛋白标准液(g/L)x竺竺

As100.5

【注意事项】

1.本法所用标本为血浆，要求标本新鲜，不能溶血。抗凝剂使用不能过量。

2.制备测定管时纤维蛋白凝块的卷起、挤压、吸干和洗涤每一步都要特别小心，避免纤

维蛋白丢失而使结果偏低。

【参考范围】

2〜4g/L

【临床意义】

1.纤维蛋白原增加纤维蛋白原是一种急性时相蛋白，其增加往往是机体的一种非特异

反应，常见于下列疾病：

(1)感染：毒血症、肺炎、轻型肝炎、胆囊炎、肺结核及长期的局部炎症。

(2)无菌炎症：肾病综合征、风湿热、恶性肿瘤、风湿性关节炎、心梗及脑梗等。

(3)其他：如外科手术、放射治疗、月经期及妊娠期也可见轻度增高。

2.纤维蛋白原减少

(1)原发性纤维蛋白原减少的病例极少。一种先天性纤维蛋白原缺乏症是极为罕见的

遗传性疾病，通过常染色体隐性基因遗传，此患者肝不能合成纤维蛋白原。男、女两性均能

发生，但以男婴为多见，患婴出生时，半数出现脐带出血，其血液凝固缓慢或只有部分凝固。

(2)继发性血浆纤维蛋白原减少的原因是由于纤维蛋白溶酶溶解纤维蛋白所致。如胎

盘早期剥离，分娩时羊水进入血液形成血栓，引起弥漫性血管内凝血，激活纤维蛋白溶酶原，

使血中纤维蛋白溶酶活力增加，溶解纤维蛋白，消耗了体内原有的纤维蛋白原，使其含量减

少。有时下降至0.5g/L以下。

(3)严重的肝实质损害，如肝坏死、慢性肝病晚期、肝硬化等

此外，严重的低纤维蛋白原血症也可见于肺及前列腺手术中。

【方法评价】

本法操作烦琐、费时，易使纤维蛋白凝块丢失，同时还能沉淀其他蛋白质，具备条件时

最好采用加入凝血醐原的凝固法或免疫比浊法。

实验八血清粘蛋白测定（酚试剂法）

粘蛋白是含粘多糖的复合蛋白质，主要存在于a1及B球蛋白中。它不被过氯酸、磺基

水杨酸等蛋白沉淀剂所沉淀，可被磷鹤酸沉淀。

【实验要求】

掌握酚试剂法测定血清粘蛋白的实验原理、方法与计算方法；学会使用离心机；练习吸

取上清液的技能。

【实验原理】

mO.6mol/L过氯酸沉淀血清中其他蛋白质时，粘蛋白不被沉淀，滤液（或上清液）中

粘蛋白用磷铛酸溶液沉淀，以酚试剂测定其中蛋白质的含量。

【试剂】

1.生理盐水。

2.1.8mol/L过氯酸取含量为70%〜72%过氯酸28ml,加蒸储水稀释至200ml。若用

60%过氯酸则需39.2ml稀释至200ml,配制后需用标准氢氧化钠标定。

3.17.74mmol/L磷鸽酸溶液称取磷鸨酸H71P（W2O7）gOg,溶于2moi/L盐酸中，

并加至100ml。

4.酚试剂于1500ml球形烧瓶中加入铝酸钠100g,铝酸钠25g,蒸储水700ml,浓磷

酸50ml,浓盐酸100ml,缓缓回流蒸储10h,取下冷凝管，加硫酸锂75g,蒸储水50ml,

并加滨水2〜3滴，再煮沸15min以除去多余的澳（亦可以30%过氧化氢6〜8滴代替），冷

却后稀释至1L。此试剂应为金黄色而不带绿色，贮棕色瓶保存。使用时按需要量用蒸储水

等量稀释后使用。（澳有毒，开启瓶塞或加溟煮沸时应在通风柜内操作！）

5.1.88mo1/L碳酸钠溶液。

6.酪氨酸标准溶液（0.05mg/ml）精确称取酪氨酸5.0mg,以O.lmol/L盐酸溶解并定容至

100m11,

【操作】

在15ml离心管中加入血清0.5ml和生理盐水4.5ml,混匀，滴加1.8mol/L过氯酸溶液

2.5ml,混匀，使血清蛋白沉淀。静止lOmin后，用定量滤纸过滤或离心。取滤液或上清液

2.5ml置于另一试管中，加17.74mmol/L磷鸨酸0.5ml混匀，使粘蛋白沉淀。静止lOmin后，

以3000r/min离心lOmin,倾去上清液并沥干，再加磷铐酸溶液2ml,悬浮沉淀物，同法离

心后倾去上清液（不可使沉淀损失！），沥干，以此管为测定管。

另取试管两支，标明标准管和空白管，按表4-8测定。

表2-5酚试剂法测定血清粘蛋白操作表

加入物/ml测定管标准管空白管

0.05mg/ml酪氨酸标准液—0.25—

蒸加水1.751.501.75

1.88mol/L碳酸钠溶液0.500.500.50

酚试剂0.250.250.25

混匀，放置37℃水浴15min,取出后在650nm波长处进行比色，以空白管调零，分别

读取各管吸光度。

【计算】

A

血清粘蛋白（mg/L）（以酪氨酸计）=—&x75

As

粘蛋白含酪氨酸为4.2%,如果粘蛋白以蛋白计发报告，只需将上述以酪氨酸计算结果

乘100/4.2（23.8）即可。

【注意事项】

L过氯酸为强氧化剂，应按危险品保存，实验操作时也应小心。

2.过氯酸沉淀蛋白在30℃以下进行较好，否则结果将偏低。操作中滴加过氯酸溶液时

速度宜慢，以30〜40s内加完2.5ml为度。速度过快易发生混浊，离心后不易得到清晰的上

清液。

3.加过氯酸溶液沉淀蛋白后，以及滤液加磷鸨酸后，均需放置lOmin再进行过滤或离心。

倾去上清液时，须细心操作，不能使沉淀丢失，否则结果偏低。

【参考范围】

以酪氨酸计为（33.8±12.7）mg/L

以蛋白计为0.71〜8.7g/L

【临床意义】

1.血清粘蛋白增高见结核病、肺炎、风湿热、风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肿瘤

（尤其是女性生殖器肿瘤）等。

2.血清粘蛋白降低见实质性肝病和肾病综合征。

【方法评价】

本法准确度低，测定结果一般偏低。

实验九血清蛋白质测定（醋酸纤维素薄膜电泳法）

【实验要求】

掌握醋酸纤维素薄膜电泳技术分离血清蛋白的原理及操作;熟悉正常人血清蛋白电泳图

谱特征；了解血清蛋白测定的临床意义。

【实验原理】

血清中各种蛋白质的等电点与分子大小有差异，电泳迁移率不同，因此，采用电泳技

术可以分离血清蛋白质。各种血清蛋白质的等电点在pH7.0以下，在pH8.6的缓冲液中带负

电荷，电场中向正极泳动，用醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白质分离为5条区带，从正极

向负极依次为清蛋白、a「球蛋白、a2-球蛋白、B-球蛋白和"球蛋白（图9-3,再经脱色、

比色，可求出各部分蛋白质的相对百分含量。

a：光密度计，I插曲线图b,电诛后染色图而

图2-1血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳示意图

【器材】

醋酸纤维素薄膜（2cmX8cm）,培养皿、滤纸、镶子、剪子、加样器（可用血红蛋白

吸管）、直尺、铅笔、玻璃板（8cmXl2cm）、电泳仪、分光光度计、吸光度计。

【试剂】

1.巴比妥缓冲液（pH8.6,0.07mol/L,离子强度0.06）取巴比妥钠12.76g、巴比妥1.66g,

加蒸储水500ml,加热溶解，冷却后用蒸储水稀释至1000ml。

2.氨基黑10B染色液取氨基黑10B0.5g,加甲醇50ml、冰醋酸10ml,混匀溶解后，加

蒸储水至100ml。

3.漂洗液取95%乙醇45ml,加冰醋酸5ml,混匀后用蒸储水稀释至100ml。

4.洗脱液0.4mol/LNaOHo

5.透明液取柠檬酸（C6H5Na3O7-2H2O）21g、N-甲基-2』比咯烷酮150g,以蒸储水溶

解，并稀释至500mL

【操作】

1.准备

（1）电泳槽准备将电泳槽置于水平平台上，两侧电泳槽中注入等量巴比妥缓冲溶液,

使槽内液面处于同一高度，液面与支架距离约2〜2.5cm,支架宽度调节到恰好适合醋酸纤

维素薄膜的长度（约8〜10cm）。用4层纱布搭桥，此即盐桥（图9-4）。

图2-2醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图

（2）薄膜准备取2cmX8cm醋酸纤维素薄膜，在膜的粗糙面一端1.5cm处用铅笔轻

划一直线，作为点样位置，并编号。将薄膜浸入巴比妥缓冲液中，待充分浸透（20min处）,

即薄膜无白色斑点后，用镜子取出，夹在滤纸中间轻轻吸去多余的缓冲液。

2.点样用加样器取血清约3〜5U1,均匀加在薄膜点样线上，待血清渗入膜内后，移开

加样器。膜上血清样本应有一定宽度、粗细均匀，不要浸润至膜边缘。

3.电泳将薄膜点样端靠近阴极，膜粗糙面向下，平整地贴于盐桥上，加盖,平衡约5min,

开启电源，调节电压为100〜160V,电流为0.4〜0.6mA/cm膜宽，通电40〜50min,待电泳

区带展开约3.5〜4.0cm,即可关闭电源。

4.染色用镣子取出薄膜，浸入染色液中2〜3min。

5.漂洗从染液中取出薄膜，沥去染液，依次浸入3〜4个漂洗皿的漂洗液中反复漂洗，直

至背景颜色脱净为止。此时即得5条蛋白色带，从阳极端起，依次为清蛋白、a,.a?、

B和丫球蛋白。

6.透明将漂净吹干的薄膜浸入透明液中3〜5min,取出平铺于洁净干燥玻片上（应无

气泡），直立片刻除去透明液，干燥后即成透明膜。此膜可扫描定量，并可长期保存。

7.定量

（1）吸光度计法：将干燥的薄膜放入微机控制的自动扫描吸光度计内，对蛋白质区带

进行扫描，自动绘出电泳图形，并直接打印出各部分蛋白质的相对百分含量。

（2）洗脱比色法：取试管6支，将0.4mol/LNaOH溶液6ml加入第1管，其余各管

加3ml。将漂净的薄膜用滤纸吸干后，剪下各条蛋白区带，并于空白部位剪一相当于清蛋白

宽度的薄膜作为空白。将清蛋白区带浸入第1管溶液，其余蛋白区带与空白区带依次浸入

后5管溶液中。于37℃水浴20min（不时振摇）。待颜色脱净，取出冷却。用分光光度计

比色，于620nm波长，以空白管调零，读取各管的吸光度值。

【计算】

T

吸光度总和（A）=2A+ai+a2+p+y（吸光度）

A

各部分蛋白质所占百分比（％）=­xlOO

Aj

Ax表示各部分蛋白（清蛋白、加、。2、P，Y）的吸光度。

【注意事项】

1.每次电泳前，电泳槽两边的缓冲液液面应保持平衡。

2.在电泳过程中，电泳槽一定要加盖密闭，电泳完毕，要先断开电源，再取出薄膜，以

免触电。

3.缓冲液越新鲜越好，不用时，宜贮于冰箱。电泳槽内的缓冲液可以连续使用数次，但

是下次电泳时，正负极要更换。

4.下述原因会引起电泳图谱分离不清或不整齐：（1）点样过多；（2）点样不均匀、不整

齐，样品触及薄膜边缘；（3）薄膜过湿致样品扩散；（4）点样速度过慢，薄膜表面局部干燥;

（5）样品不新鲜或溶血；（6）薄膜与盐桥接触不良；（7）薄膜位置与电流方向不平行；（8）

缓冲液变质。

【参考范围】

各实验室应根据不同的实验条件及检测方法和检测对象设定参考值范围，表9-1仅供参

考。

表2-6氨基黑10B染色洗脱法参考范围

血清蛋白质组分占总蛋白的百分数/%

清蛋白57.45〜71.73

1球蛋白1.76〜4.48

a2球蛋白4.04〜8.28

B球蛋白6.79〜11.39

Y球蛋白11.18〜22.97

【临床意义】

1.慢性肾炎、肝硬化时，清蛋白降低，Y球蛋白升高2〜3倍。

2.肾病综合征时，清蛋白降低，a2及B球蛋白升高。

3.结缔组织病（如红斑狼疮，类风湿性关节炎等）时，丫球蛋白显著升高。

4.多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，Y球蛋白增多，于B球蛋白和丫球蛋白区带之间出现

“M”带。

第三章体液葡萄糖及其代谢物测定

实验十血糖测定（GOD-POD法）

【实验要求】

掌握血糖测定葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶（GOD-POD法）的原理，操作方法。能及时

发现和解决实验中出现的问题。

【实验原理】

葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢。在过氧化氢酶

（POD）及色原性受体4-氨基安替比林（4-AAP）的存在下，过氧化氢释放氧使色素原氧化

生成红色醍类化合物。配的生成量与葡萄糖成正比，在波长505nm处比色，求得葡萄糖含

量。

GOD

葡萄糖HO＞葡萄糖酸+

+o2+2H2O2

2H2O2+4-AAP+酚一史—醍亚胺+4H2O

【试剂】

有商品试剂盒供应。例如，某试剂盒的成分与参考浓度：

1.葡萄糖氧化酶200U/L；过氧化物酶》1200U/L；4-氨基安替比林0.8mmol/L；

DHBS（3、5-二氯-2-羟基苯磺酸钠）3.5mmol/L；磷酸缓冲液pH7.0iOOmmol/L；稳定剂适

量。

2.葡萄糖标准液5mmol/L

【操作】

1.自动分析法按仪器说明书的要求进行测定。

2.手工操作法取试管3支，按表3-1操作

表3-1GOD-POD法测定血糖操作步骤

加入物（ml）空白管标准管测定管

血清——0.02

葡萄糖标准液—0.02—

蒸锵水0.02——

酶工作液2.02.02.0

混匀，置37℃水浴，保温在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管

及测定管吸光度。

【计算】

血清葡萄糖（nunol/L）=।＞x标准液浓度（相机〃/L）

标准管吸光度

【参考范围】

空腹血清葡萄糖为3.89~6.11mmol/L（70~11Omg/dl）

（或参考试剂盒提供的参考范围）

【临床意义】

1.生理性高血糖见于饭后1〜2h,注射葡萄糖或摄入高糖食物后、情绪紧张肾上腺素

分泌增加时，但不应超过lOmmol/Lo

2.病理性高血糖见于（1）内分泌腺功能障碍能引起高血糖，如胰腺B细胞损害导致胰岛

素分泌缺乏，血糖可超过正常，临床上称为糖尿病。其他内分泌疾病引起的各种对抗胰岛素

的激素分泌增加也会出现高血糖；（2）颅内压增高：颅内压增高刺激血糖中枢，如卢页外伤、

颅内出血、脑膜炎等；（3）由于脱水引起的高血糖：如呕吐、腹泻和高热等可使血糖轻度增

高。

3.生理性或暂时性低血糖见于饥饿、剧烈运动、注射胰岛素后、妊娠和服用降糖药后。

4.病理性低血糖见于（1）胰岛B细胞增生瘤等，使胰岛素分泌过多；（2）对抗胰岛素的

激素分泌不足，如垂体前叶功能减退，肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、

肾上腺皮质激素分泌减小；（3）严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝

脏不能有效地调节血糖。

【方法评价】

葡萄糖氧化酶法因其操作简便、特异性高，已作为临床实验室测定血糖的主要方法。本

法线性范围可达23mmol/L,但溶血（胆色素＞0.34mmol/L）,左旋多巴（0.5mmol/L）,锹

甘肽，维生素C等还原性物质均可使测定结果下降。