高良姜素对LPS诱导THP-1细胞炎症的保护作用

高良姜素对LPS诱导THP-1细胞炎症的保护作用［摘要］目的：探讨高良姜素对脂多糖（LPS）诱导人急性单核细胞白血病细胞株THP-1细胞炎症的保护作用及其可能的机制。方法：MTS法检测细胞活性；酶联免疫吸附（ELISA）法检测TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的分泌；免疫印迹（WesternBlot）法检测NF-κB以及MAPK通路相关蛋白的变化。结果：高良姜素在0-20μmol/L范围内对细胞活力无明显影响。LPS的用药浓度为500ng/mL；与LPS模型组相比，高良姜素2.5-20μmol/L能有效抑制炎症因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的释放（P＜0.05）；高良姜素20μmol/L能抑制NF-κB通路IκBα的磷酸化，从而减少核转位因子NF-κB的核转位，但对MAPK通路无影响；结论：高良姜素对LPS刺激的THP-1细胞炎症具有一定的保护作用，其保护机制可能与其调控NF-κB通路，抑制IκBα的磷酸化，减少NF-κB的核转位，进而抑制TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的表达有关。［关键词］：高良姜素；THP-1；脂多糖；抗炎；NF-κB;MAPK高良姜素(galangin)是一种天然的黄酮醇类化合物,近年来国内外对该成分的药理药效活性进行了大量研究,实验证明高良姜素具有抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化等作用ADDINNE.Ref.{8BAD2C36-1F3B-44E6-A9EF-4178C212D7C7}[1-3]，而关于其抗炎活性方面的研究较少。巨噬细胞分泌多种炎症介质介导炎症反应，包括TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6ADDINNE.Ref.{D3D4D2DA-1820-4AAD-BF17-05F913DFBBB9}[4]等，而这些炎症介质的产生与NF-κB以及MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）通路有着密切的关系ADDINNE.Ref.{142AD3DF-9A60-4D40-A439-A1328A3D8183}[5,6]。基于此，本实验选用LPS诱导THP-1细胞作为体外炎症模型，探讨高良姜素在该模型中是否具有抗炎作用以及抗炎的机制。1.材料1.1.1药品与试剂高良姜素（广东省食品药品检验所,批号62.111699）；THP-1细胞系购自上海细胞库；LPS（sigma，批号L2880）；MTS（promega）；ELISA试剂盒（达科为）；IκBα、p-IκBα、p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、P38、p-p38、GAPDH、PCNA、NF-κB(P65)(cellsignalingtechnology)。1.1.2仪器超净工作台（Thermo）、细胞CO2培养箱（newbrunswick）、普通光学显微镜（Leika）、多功能酶标仪（biotek）、台式冷冻离心机（EppendorfResearch）、高压蒸汽灭菌锅（HIRAYAMA）、电泳仪（Bio-Rad）。2.方法2.1MTS法检测高良姜素对LPS刺激后THP-1细胞增殖的影响：实验分组：对照组、LPS刺激组（500ng/mL）、4个不同浓度高良姜素处理组（2.5、5、10、20μΜ/L）、4个不同浓度高良姜素（2.5、5、10、20μΜ/L）+LPS处理组。在37℃,5%CO2培养箱内培养6、12、24h后,每孔加入20ulMTS溶液,继续培养2-4h，酶标仪测490nm下吸光度。2.2ELISA法检测高良姜素对LPS刺激THP-1细胞表达TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影响实验分组（同2.1），分别培养6h、12h、24h，收集3个时间段细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书的要求进行操作，最后使用酶标仪进行检测，测得的数据经电脑软件处理。2.3高良姜素对LPS刺激THP-1细胞NF-κB通路以及MAPKs通路的影响实验分组：空白对照组，500ng/mLLPS处理组（分别处理15min、30min、45min）、500ng/mLLPS+20μmol/L高良姜素组（分别处理15min、30min、45min）。根据实验分组，制备蛋白上清，调整蛋白浓度，电泳，转膜，封闭，孵育一抗，孵育二抗，显色，曝光。2.4高良姜素对LPS刺激后THP-1细胞NF-κB（P65）转位的影响实验分组：空白对照组、LPS（500ng/mL）组、20μmol/L高良姜素组、LPS+20μmol/L高良姜素组。药物作用12h后，按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书要求分别提取核蛋白以及胞浆蛋白，westernBlot法检测NF-κB（P65）转位，方法同2.4。2.5统计学处理采用spss13.0统计软件进行数据分析处理，所有计量资料采用均数±标准（±S）表示，组间差异只有两组时用t检验，有多组时用单因素方差分析。以P＜0.05作为具有显著统计学差异的检验标准。3.结果3.1高良姜素对LPS刺激THP-1细胞增殖的影响空白对照组、LPS模型组、不同浓度高良姜素组（2.5、5、10、20μmol/L）、不同浓度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）+LPS组作用于THP-1细胞株6、12h后，与空白对照组比较，LPS模型组细胞活力明显下降（P＜0.05），而不同浓度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）单独作用对细胞活力无明显影响（P＞0.05）。不同浓度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）+LPS组与LPS模型组相比细胞活力无明显变化（P＞0.05）。见图1。与空白组相比#P＜0.05图1：高良姜素对LPS刺激THP-1细胞增殖的影响（±S，n=3）3.2高良姜素对LPS刺激THP-1细胞表达TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影响与空白对照组相比，LPS模型组THP-1细胞分泌TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6均显著增加（P＜0.05）。给予高良姜素后，高良姜素能抑制TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的分泌（P＜0.05），并呈一定的浓度以及时间依赖性。见图2。图2A图2B图2C图2D与空白组相比#P＜0.05，与模型组相比*P＜0.05图2.高良姜素对LPS刺激后THP-1细胞表达TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影响（±S，n=3）3.3高良姜素对LPS刺激THP-1细胞表达NF-κB、MAPKs通路的影响与空白组相比，给予LPS刺激后15、30、45min，THP-1细胞表达p-ERK、p-P38、p-JNK、p-IκBα明显增加，IκBα表达下降。高良姜素能抑制LPS刺激后的p-IκBα的表达，同时使IκBα的表达增加，而对p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表达无明显影响。见图3。图3.高良姜素对LPS刺激THP-1细胞表达NF-κB、MAPKs通路的影响3.4高良姜素对LPS刺激THP-1细胞NF-κB（P65）转位的影响与空白对照组相比，LPS模型组胞浆内NF-κB（P65）蛋白表达降低（P＜0.01），胞核内NF-κB（P65）蛋白表达升高（P＜0.01）；与LPS模型组相比，高良姜素+LPS组胞浆内NF-κB（P65）蛋白表达增加（P＜0.01），胞核内表达减少（P＜0.01），并呈一定的浓度依赖。见图4。图4A图4B图4C与空白组相比##P＜0.01，与模型组相比*P＜0.05**P＜0.01图4：高良姜素对LPS刺激THP-1细胞NF-κB（P65）转位的影响（±S，n=3）讨论：脂多糖（LPS）又称为内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,作为一种重要的外源性促炎成分，LPS与循环血中的LPS结合蛋白（LPSbindingprotein，LBP）结合后，作用于细胞膜受体，通过多条信号转导通路，如NF-κB通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）通路活化单核巨噬细胞ADDINNE.Ref.{EA855688-B186-4FA0-B1A5-7BDF2A353D0C}[7]，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等多种炎症介质生成ADDINNE.Ref.{688F7A16-3229-4F93-8683-39259F238B3F}[8-10]。TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1又称为促炎细胞因子，处于炎症瀑布反应的中心位置，可活化内皮细胞、单核巨噬细胞以及各种白细胞，引起组织细胞坏死。本研究发现，高良姜素在0-20μmol/L浓度范围内对细胞活力无明显影响。LPS刺激THP-1细胞后，炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1表达显著增加，高良姜素能够抑制这些炎症介质的表达，并具有一定的时间以及剂量依赖性，说明高良姜素具有抗炎活性。NF-κB通路以及MAPK通路是炎症反应过程中两条重要的细胞通路ADDINNE.Ref.{2FA421DB-5418-4194-B46F-3B9C5E424970}[11,12]，与多种炎症介质的产生密切相关。NF-κB是早期核转录因子，属于ReL家族，主要以P50/P65异源二聚体形式广泛存在于真核细胞中。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子是NF-κB的下游调控因子，NF-κB活化后可调控宿主细胞炎症因子的基因转录。在静息状态下，NF-κB和IκBα形成复合体存在于胞浆中。当受到刺激后，IκBα激酶复合体(IKBkinase，IKK)活化将IκBα磷酸化，使NF-κB与IκBα解离，游离的NF-κB迅速移位到细胞核ADDINNE.Ref.{3D335FB2-9B86-46AD-A31F-B48B32BD0D6E}[13]，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等相关基因的转录。MAPK通路是细胞应激和损伤反应的主要信号通路ADDINNE.Ref.{726F2B30-D4DE-4A6D-96FB-E989D89911F9}[14]。MAPK家族三条经典的亚族通路分别是细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）ADDINNE.Ref.{BCEC4609-E0DB-488C-8372-01D6CD950C5F}[15]。这些MAPK通路被LPS等多种因素激活后，通过复杂的细胞内信号的转导，可产生大量的炎症介质，从而促进炎症反应的发生ADDINNE.Ref.{629609AB-C049-4B9B-B4E5-38076EF4AA8C}[16]。ERK、JNK、p38MAPK通路活化的标志是其磷酸化形式表达量的增多。本实验结果显示，当THP-1细胞受到LPS刺激后，THP-1细胞内NF-κB、MAPKs通路活化，p-ERK、p-P38、p-JNK、p-IκBα表达明显增加，相应的ERK、P38、JNK、IκBα表达下降。应用高良姜素后，高良姜素能够抑制LPS刺激后的p-Iκ