丙胺酸立体异构物与L

CH03

胺基酸、胜肽與蛋白質

生物化學

【第5版】3.1胺基酸3.2胜肽與蛋白質3.3蛋白質的操作與分析3.4蛋白質的結構：一級結構p.73p.73數以千計不同蛋白質的結構是由相當簡單的單體次單元所決定。所有蛋白質，不論是來自最古老的細菌品系或最複雜的生命型態，皆由同樣20種廣泛存在的胺基酸所組成，共價聯結為線性序列。由於這20種胺基酸均具有特殊化學性質之支鏈官能基，我們可將之視為編寫蛋白質結構的語言所使用之字母。最令人嘆為觀止的是細胞能將這20種胺基酸以各種不同的組合與序列編排製造出性質差異甚鉅的蛋白質。Peptide(約小於50個胺基酸聚合成的分子)Protein(較長的polypeptide)蛋白質是胺基酸聚合成的複雜巨分子之總稱。這些巨分子是由20種不同的胺基酸聚合組成，蛋白質的特性會依胺基酸聚合排列不同而變化。蛋白質:生理功能的執行者p.74圖3-1一些蛋白質的功能。(a)螢火蟲所發出的光是由螢光素（luciferase）催化螢光素（luciferin）與腺苷三磷酸（ATP）參與的化學反應所產生的（詳見Box13-1）。(b)紅血球中含有一種大量的氧氣運輸蛋白－血紅蛋白。(c)角質素在所有脊椎動物均有表現，是組成毛髮、鱗片、角、羊毛、指甲和羽毛等之重要結構成分；圖中的黑犀牛已瀕臨絕種，因為某些地區一直以來認為犀牛角製成粉後可作為有效的壯陽藥物，但事實上，犀牛角的化學性質與牛角或人類的指甲並無任何差異。圖3-13.1胺基酸p.73蛋白質是胺基酸的聚合物，由每一個彼此相鄰的胺基酸殘基（aminoacidresidue）以一種特殊的共價性鍵結作聯結。胺基酸具有共同之結構特徵常見的20種胺基酸都是α-胺基酸，它們的羧基與胺基都是鍵結到同一個碳原子（即α碳）（見圖3-2）。這些胺基酸彼此之間的差異就在其支鏈R基團（Rgroups）上，其結構、大小與帶電性的差異也影響到各種胺基酸在水中的溶解度。p.74圖3-2胺基酸的一般結構。除了脯胺酸這個環狀胺基酸之外，此結構適用於其他所有α-胺基酸。每個胺基酸的差異在於連接到α碳（藍色）上的R基團或支鏈（紅色）不同。圖3-220種常見胺基酸已被賦予由三個英文字母組成的縮寫及以一個英文字母代表的符號（表3-1），通常在表示蛋白質的胺基酸序列及組成時使用。除了甘胺酸外，所有常見胺基酸的α碳原子上均鍵結了四種不同基團：羧基、胺基、R基團與一個氫原子（圖3-2；在甘胺酸中R基團為另一個氫原子）；因此α碳原子是一個對掌中心（chiralcenter）。由於α碳原子附近之鍵結軌域呈現正四面體排列，因此這四個相異基團具有兩種獨特的空間排列，也因此胺基酸具有兩種可能之立體異構物；由於兩者互為不能重疊的鏡像（圖3-3），因此這兩種立體異構物稱為對映體（enantiomers）（見圖1-19）。p.74p.75表3

-

1p.76圖3-3

α-胺基酸的立體異構化現象。(a)L-與D-丙胺酸互為不能重疊的鏡像異構物（即對映體）。(b)、(c)則為兩種呈現立體異構物空間組態的表示法。(b)結構透視式（perspectiveformulas）：實心三角柱形表示此鍵結會突出紙面向外，而虛線則表示該鍵結穿入紙面向內。(c)投影分子式（projectionformulas）：水平鍵結表示突出紙面向外，垂直者則表示穿入紙面向內。其中，以後者較為常用，且多半並不用於描繪特定的立體化學組態。圖3-3所有具有對掌中心的分子都具有光學活性（opticallyactive），也就是它們都能轉動平面偏極光（參見Box1-2）。為了明確定義這非對稱碳原子上的四個取代基之絕對組態（absoluteconfiguration），我們使用了另一套特殊的命名法；單醣與胺基酸的絕對組態都是用D,L系統（D,Lsystem）（見圖3-4）加以命名的。在Fischer的命名系統中，L與D僅用以表示對掌性碳原子周圍四個取代基的絕對組態，與整個胺基酸分子的光學性質無關。p.74p.76圖3-4丙胺酸立體異構物與L-和D-甘油醛之絕對組態間之立體關係。在這些結構透視式中，將碳原子作垂直排列，光學對稱原子則置於中央；碳原子從最接近末端醛基或羧基者（紅色）開始以1至3從上至下編號。以此方式表示時，胺基酸之R基團（在此為丙胺酸中之甲基）將固定出現在α碳的下方，L-胺基酸之α-胺基位於左方，D-胺基酸之α-胺基則位於右方。圖3-4■重要慣例：胺基酸的三字母代碼很明顯地是由胺基酸名稱的前三個字母所組成。■重要慣例：胺基酸中碳原子之編號排序有兩種命名系統，可能造成些許混淆。第一種編號方式是將R基團中的碳原子，從連接在α碳原子上起新增的每個碳原子依序以β,γ,δ,ε編號；然而對大多數其他有機分子而言，碳原子的編號都是將一端取代基原子序最大的碳原子定作C-1。若沿用此系統，則胺基酸的羧基碳原子將被定作C-1，而α碳原子將為C-2，以此類推。p.74■重要慣例：有些情況下，如胺基酸R基團為雜環者，若以希臘字母系統編號將造成混亂，因此將沿用傳統C-1，C-2之編號方式。對於分支的胺基酸側鏈具有同一位置碳原子時，則給予希臘字母加上數字編號。因此白胺酸具有δ1與δ2碳原子（參見圖3-5）。p.76蛋白質中之胺基酸殘基均為L-型立體異構物幾乎所有具對掌中心的生物化合物都僅以一種立體異構物的狀態天然存在，非D即L。蛋白質分子中的胺基酸殘基就都是L型異構物。但對生物體而言，D,L型異構物的差異就像右手與左手一般，要形成蛋白質中穩定而具重複性的序列（第4章），一般而言它的組成分胺基酸確實必須是屬於同一種立體化學系列的。p.76胺基酸可由其R基團加以分類了解這20種常見胺基酸化學性質有助於我們對生物化學的理解。胺基酸可由其R基團（表3-1）的性質分為五大類，特別是其極性（polarity）或在生物體pH值7.0環境下與水發生交互作用的傾向；R基團的極性差異很大，從非極性與疏水性（非水溶性）到高度極性與親水性（水溶性）。常見20種胺基酸的結構如圖3-5所示，其部分性質則列於表3-1。p.77FIGURE1-5p.47圖3-5FIGURE1-5p.77圖3-5蛋白質中常見的20種胺基酸。圖中結構式表示在pH7.0時各種胺基酸之主要離子化狀態；未上色者為各種胺基酸結構相同的部分，紅色區塊則表示R基團。雖然組胺酸的R基團是以不帶電的狀態呈現，但由其pKa值（詳見表3-1）可推算在pH7.0時此基團是部分帶電的。組胺酸的質子化形式如圖3-12b所描述。圖3-5(續)非極性、脂肪族R基團此類胺基酸的R基團是非極性與疏水性的。丙胺酸（alanine）、纈胺酸（valine）、白胺酸（leucine）與異白胺酸（isoleucine）的支鏈在蛋白質中會藉由疏水性作用力群集在一起以穩定蛋白質結構。甘胺酸（glycine）為構造最簡單的胺基酸，雖然被劃分為非極性胺基酸，但其支鏈氫原子太小了以至於無法對疏水性作用有任何貢獻。甲硫胺酸（methionine）是胺基酸中兩個具有硫者之一，其支鏈為非極性的硫醚基團。p.77脯胺酸（proline）的脂肪族支鏈為特殊的環狀構造，其二級胺（亞胺）基團被固定在一個極為緊緻的構形中，因此含有脯胺酸的多肽區域其結構彈性會大幅降低。p.78芳香族R基團此類胺基酸包含苯丙胺酸（phenylalanine）、酪胺酸（tyrosine）與色胺酸（tryptophan）三種，其芳香族支鏈是相對較非極性的（疏水性的），三者均能參與疏水性交互作用。酪胺酸與色胺酸之極性遠較苯丙胺酸大，這是因為酪胺酸具有羥基而色胺酸之環中具有氮的緣故。色胺酸與酪胺酸（苯丙胺酸則較差）會吸收紫外光（見圖3-6與Box3-1），這也是蛋白質在波長280nm附近會有強吸光之成因；此特性也被科學家用來定量蛋白質。p.78FIGURE1-5p.78圖3-6芳香族胺基酸可吸收紫外光。比較芳香族胺基酸色胺酸與酪胺酸在pH6.0時之吸收光譜，發現兩者在相等莫耳濃度之下（10－3M），色胺酸之吸光值為酪胺酸的四倍；兩者之最大吸收波長則均接近280nm。另一種圖中未標示的芳香族胺基酸苯丙胺酸吸光值甚低，通常對蛋白質的光譜性質無貢獻。圖3-6極性、不帶電R基團此類胺基酸遠較非極性胺基酸易溶於水，即其親水性較強；因為其R基團可以與水形成氫鍵。此類胺基酸包含絲胺酸（serine）、酥胺酸（threonine）、半胱胺酸（cysteine）、天冬醯胺（asparagine）與麩胺醯胺（glutamine）五種。兩分子半胱胺酸很容易經由氧化作用形成具有雙硫鍵結之產物胱胺酸（cystine）（圖3-7），此經由雙硫鍵聯結之殘基則變得極為疏水性（非極性）。雙硫鍵在許多蛋白質結構中扮演非常特別的角色，它可能將蛋白質分子的不同區域或是將兩條多肽作共價鍵結。p.78FIGURE1-5p.78圖3-7

兩分子半胱胺酸可氧化形成具雙硫鍵的胱胺酸，亦能進行可逆還原反應。雙硫鍵之形成有助於穩定許多蛋白質的結構。圖3-7帶正電（鹼性）R基團親水性最強之R基團就是帶正電或負電之支鏈官能基。在pH7.0時R基團帶最強正電之胺基酸是離胺酸（lysine），它在其脂肪族支鏈末端ε位置帶有第二個一級胺基。精胺酸（arginine）具有一個帶正電的胍基團；另外則是帶有咪唑基團之組胺酸（histidine）。組胺酸是唯一具有pKa

值接近中性之離子化支鏈的胺基酸，在許多酵素催化反應中，組胺酸扮演質子提供者與接受者之角色來促進反應之進行。p.78帶負電（酸性）R基團在pH7.0時R基團帶有淨負電的兩個胺基酸為天冬胺酸（aspartate）與麩胺酸（glutamate），兩者均具有第二個羧基。p.79特殊胺基酸也具有重要功能除了20種常見胺基酸之外，蛋白質序列中也可能含有由常見胺基酸殘基經化學修飾作用產生的特殊胺基酸殘基（圖3-8a）。4-烴基脯胺酸（4-hydroxyproline；脯胺酸的衍生物）與5-烴基離胺酸（5-hydroxylysine；離胺酸的衍生物），前者出現於植物細胞壁蛋白質中，兩者也都存在於膠原蛋白中。6-N-甲基離胺酸（6-N-Methyllysine）是肌球蛋白的組成分之一。p.79γ-羧麩胺酸（γ-carboxyglutamate）也是一種相當重要的特殊胺基酸，存在於凝血蛋白凝血原及其他會與鈣離子結合的蛋白質中。鎖鏈離胺素（desmosine）則是一種較為複雜的特殊胺基酸，它是由四個Lys殘基所組成的衍生物，存在於一種纖維狀蛋白質－彈性蛋白中。硒半胱胺酸（selenocysteine）則是一種特殊的類型，這種特殊胺基酸殘基是在蛋白質生合成過程中即加入，而非經由合成後修飾作用產生的。鳥胺酸（ornithine）與瓜胺酸（citrulline；圖3-8c）是精胺酸生合成與尿素循環重要的中間代謝產物。p.79圖3-8(a)

p.80圖3-8特殊胺基酸。(a)蛋白質中有時也能發現特殊的胺基酸，它們全是由常見的一般胺基酸衍生而得的，由修飾作用加上的特殊官能基以紅色表示。鎖鏈離胺素則是由4個離胺酸組成（4個碳原子骨架以黃色表示），數字或希臘字母則用以標示這些碳原子。圖3-8(b)

p.80圖3-8特殊胺基酸。(b)可逆的胺基酸修飾涉及了蛋白質活性的調控。磷酸化是最普遍的調控修飾之一。BOX1-2FIGURE1p.79BOX3-1分子吸收光：比爾定律當結晶物質溶解使得熵增加許多生物分子會在特定波長吸收光，如色胺酸會在波長280nm吸收光（圖3-6）。在特定波長下，入射光被溶液吸收的比例會與吸收層的厚度（即光徑長）與吸光物種之濃度有關（圖1）。這兩種關係可組合為比爾定律：log（I0/I）所表示的即為吸光率（absorbance），命名為A。莫耳消光係數會因吸光化合物之本質、溶劑、波長，甚至pH值（若吸光物種與吸光性質不同的另一種游離態達平衡時）而異。BOX1-2FIGURE1p.79BOX3-1分子吸收光：比爾定律(續)圖1分光光度計之主要構成要素。光源發出涵蓋廣泛光譜之光，單色儀選擇並傳導特定波長之光。單色光通過光徑長為l之比色管中的樣品溶液，並以與吸光物種濃度成比例之方式被樣品吸收。穿透光之強度則可由偵測器測得。胺基酸可作為酸亦能作為鹼當胺基酸的胺基和羧基與某些胺基酸的可解離R基團在一起時，可作為弱酸或弱鹼。當沒有可解離R基團的胺基酸溶於水時，會以雙質子離子或兩性離子狀態存在（圖3-9）。具有兩性（amphoteric）特性的物質通稱為兩性電解質（ampholytes）。一個簡單的單胺基單羧基α-胺基酸，如丙胺酸，當它完全質子化時將成為一雙質子酸，它的兩個基團：─COOH基與─NH3

＋基均能釋出質子：p.81p.81圖3-9p.81圖3-9胺基酸之非離子化與兩性離子狀態。水溶液中未離子化的胺基酸所占比例很低，在中性pH值時胺基酸主要以雙性分子狀態存在。而雙性分子可以是酸（質子提供者）或是鹼（質子接受者）。胺基酸具特有之滴定曲線酸鹼滴定是指一個逐步添加或移除質子的過程。圖3-10為雙質子態甘胺酸的滴定曲線，此圖形具有兩個特別顯著的階段，對應於甘胺酸上兩個不同基團的去質子化過程。滴定之第二階段對應於自─NH3＋

基團移除質子之過程。由甘胺酸之滴定曲線可獲得一些重要資訊。第一點，此滴定曲線可協助我們測得甘胺酸上兩個離子化基團之pKa

值：即─COOH基為2.34、─NH3＋

基為9.60。p.81

圖3-10p.81圖3-10胺基酸之滴定。本圖為0.1M甘胺酸在25℃時之滴定曲線。滴定過程中各階段重要之離子化物種如圖上方所示。陰影區以pK1＝2.34與pK2

＝9.60為中心，顯示這些區域之pH值具有最大的緩衝能力。注意！1個當量的OH－＝加入0.1MNaOH。甘胺酸之羧基pKa

值之所以有如此大的差異應來自於α-碳原子上待脫離質子與鄰近正價胺基之間的排斥作用，如圖3-11所示，此兩性離子上相反電荷基團間產生的穩定效應將使平衡反應大幅趨向右方。第二點資訊是，此胺基酸在兩個pH範圍中具有緩衝力。p.82

圖3-11p.82圖3-11化學環境對pKa值之作用效應。甘胺酸中可離子化基團之pKa

值比一般較簡單、甲基取代的胺基或羧基者為低。這些造成pKa值降低的因素來自於分子內交互作用。鄰近胺基酸殘基的化學基團會產生相似的效應，例如：酵素的活性部位。滴定曲線可估算胺基酸帶電情形胺基酸淨電荷為0的特定pH值稱為等電點（isoelectricpoint）或等電pH值（isoelectricpH），簡稱為pI。以甘胺酸為例，由於不具支鏈官能基，它的等電點可從兩pKa值之算數平均值求得：p.82胺基酸彼此之間酸鹼性質各異各種胺基酸彼此之間共有之性質可讓我們將其酸鹼性質簡化歸納出幾個通則。第一、所有只具一個α-胺基、一個α-羧基與一個非離子化R基之胺基酸其滴定曲線幾乎與甘胺酸相同（圖3-10）。第二、具有可離子化R基之胺基酸其滴定曲線較為複雜，其有三個滴定階段，分別對應於三個離子化步驟，因此它們具有三個pKa

值。由離子化R基所產生的額外一個滴定階段會與另兩個階段有某些程度的混合現象，在此以兩種屬於此類型之胺基酸的滴定曲線為例，它們分別是麩胺酸與組胺酸（圖3-12）。p.83圖3-12

p.83圖3-12

(a)麩胺酸與(b)組胺酸的滴定曲線。R基團之pKa

值在此以pKR表示。總結3.1常見20種胺基酸以殘基方式存在於蛋白質中，包含一個α-羧基、一個α-胺基與一個特定的R基取代於α-碳原子上。除了甘胺酸之外，所有胺基酸之α-碳原子均為非對稱性的，因此胺基酸至少可以兩種立體異構物狀態存在。現有蛋白質中僅發現L-型胺基酸之存在。另有其他較不常見的胺基酸存在，它們可作為蛋白質的組成物（蛋白質合成完成後藉由修飾一般正常胺基酸殘基而產生）或是作為游離態的代謝物。胺基酸可以其R基團之極性或帶電性（在pH7時）區分成五大類。p.84胺基酸之酸鹼性質差異很大並具有特定的滴定曲線。具單一胺基與單一羧基之胺基酸（R基團不能離子化者）在低pH值時為雙質子酸（＋H3NCH(R)COOH），而隨著環境pH值升高會形成多種不同之離子化形式。具有可離子化R基團之胺基酸則具有額外的離子化物種，隨環境pH值與R基團之pKa值而異。p.843.2胜肽與蛋白質胜肽為胺基酸結合成之鏈狀體兩個胺基酸可藉由一取代之醯胺鍵結，即肽鍵（peptidebond）作共價性聯結形成所謂雙肽。此鍵結是由一個胺基酸之羧基及另一胺基酸之胺基共同脫去一個水分子而形成（圖3-13）。當只有幾個胺基酸連結時，其結構稱為寡肽（oligopeptide）。而當許多胺基酸連結時，其產物則稱為多肽（polypeptide）。圖3-14描繪的是一個五肽的結構。如前文已提到的，未形成胜肽的胺基酸通常稱為殘基。p.84胜肽中位於左端具有游離胺基的胺基酸殘基稱為胺基端（amino-terminal）或N-端殘基，而位於右端具有游離羧基的則稱為羧基端（carboxyl-terminal）或C-端殘基。p.85圖3-13

p.84圖3-13縮合反應形成肽鍵。官能基標示為R2之胺基酸中之α-胺基可作為親核性反應基團，取代另一個標示為R1之胺基酸中的─OH基，以形成肽鍵（黃色）。胺基是一種絕佳的親核性反應基團，然而─OH基卻是一種很差的離去基且不容易被取代。在生理條件的pH值下，此反應不容易直接發生。圖3-14

p.84圖3-14五肽（Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu）。胜肽的命名是由胺基端殘基開始，一般位於左端。肽鍵以黃色表示，R基團則為紅色。■重要慣例：當要展示一個胜肽、多肽或是蛋白序列時，胺基端會被放在左手邊而羧基端則是放在右手邊。因此，序列是從胺基端開始由左向右讀取。p.85胜肽可由其離子化行為加以區分胜肽僅具一個游離胺基與一個游離羧基，分別位於鏈狀結構兩端（圖3-15）。具生物活性的胜肽與多肽之大小及組成差異甚鉅具有生物活性之胜肽與蛋白質之功能與分子量大小間之關係並無一通則可加以規範。商品化合成的雙肽：如天冬胺酸-苯丙胺酸甲酯（俗稱為阿斯巴甜）就是一種為人熟知並廣泛使用之代糖。p.85圖

3-15

p.85圖3-15四肽。此四肽具有一個游離α-胺基、一個游離α-羧基與兩個離子化R基團。在pH7.0時可離子化基團以紅色表示。Peptide:

有許多peptide具有生理活性

例如:三個胺基酸組成的Tripeptide:glutathione(γ-glutamyl-L-cysteinylglycine)。幾乎存於各種生物體，參與許多重要的生理功能。

DNA與一些生物分子的合成藥物與環境毒物的代謝胺基酸的輸送。充當有效的還原劑(被氧化)5.2胜肽催產素(Oxytocin):在分娩時會剌激子宮肌肉的收縮，哺乳時能促進乳汁的分泌。血管增壓素(vasopressin):是抗利尿激素(antidiuretichormone)，在血壓低與高血鈉濃度被分泌出來，可助腎臟留住水分。Met-enkephalin與leu-enkephalin:屬於鴉片peptide(opioidpeptides)，能緩解痛產生興奮的感覺。心房利鈉因子:剌激稀尿的產生，與血管加壓素具相反效果。NPY與galanin:抑制食慾的peptides。物質P與緩動素:剌激痛覺，與鴉片類peptides具相反的作用。表3-2

p.86表3-3p.86部分蛋白質含有胺基酸以外之化學基團有些蛋白質除了胺基酸之外還具有永久結合之化學組成分，這些蛋白質稱為共軛蛋白質（conjugatedproteins），其中非胺基酸的部分稱為輔基（prostheticgroup）。共軛蛋白質可就其所含輔基的化學性質為基礎加以分類（表3-4），例如：脂蛋白（lipoproteins）含有脂質；醣蛋白（glycoproteins）含有糖基；而金屬蛋白（metalloproteins）則含有特定金屬原子。p.87總結3.2胺基酸可經由肽鍵共價聯結成胜肽與蛋白質。細胞中含有數以千計不同種類的蛋白質，每一種蛋白質都具有不同的生物功能。蛋白質可以是由長達一百至數千個胺基酸殘基所組成的長多胜肽，然而也有少數天然存在的胜肽是僅由幾個胺基酸殘基所構成的。有些蛋白質是由數個非共價性聯結的多肽鏈（稱為次單元）所組成。簡單的蛋白質水解後僅會得到胺基酸，共軛蛋白質則含有額外的組成成分如金屬或有機輔基。p.87表3-4p.873.3蛋白質的操作與分析p.87蛋白質可分離與純化在一種蛋白質的性質與活性能明確決定前，製備出高純度的蛋白質是絕對必須的。蛋白質的來源一般是組織或微生物細胞。蛋白質純化的第一步驟就是將這些細胞打破，使其蛋白質釋出至溶液中，此部分即稱為粗萃取物（crudeextract）。一般粗萃取物會先以基於蛋白質大小或電荷差異為基礎的處理方法加以分離，稱為分劃（fractions）或分部分離（fractionation）。透析（dialysis）就是一種利用蛋白質大分子性質而將之交換溶劑的方法。功能最強大的分劃方法是管柱層析法（columnchromatography）。它是利用蛋白質之大小、電荷、結合能力與其他性質之差異加以分離（圖3-16）。離子交換層析法（ion-exchangechromatography）是利用在特定的pH值下，蛋白質淨電荷之正負與帶電量的差異來進行純化。管柱基質是一個具有帶電基團的合成聚合物（樹酯）；帶陰離子的基團稱為陽離子交換劑（cationexchangers），而帶陽離子的基團稱陰離子交換劑（anionexchangers）。p.88圖

3-16

p.88圖

3-16(續)

p.88圖3-16管柱層析法。標準的層析管柱元件包含底部的一個固相多孔狀墊片（基質)，材質大多為塑膠或玻璃，讓溶液（為移動相）可以流通過基質（為固定相）。管柱底部之流出液會不斷被上方儲液槽中加入的緩衝溶液取代。待分離的蛋白質樣品混合溶液亦由上方置入管柱中，待其完全沒入固定相後再繼續補充緩衝液。隨著蛋白質混合液在管柱中移動，各種不同蛋白質會與固定相基質間產生程度不同的交互作用。隨著蛋白質樣品往管柱底部移動，各種蛋白質色帶（如圖蛋白質A為藍色、B為紅色、C為綠色）會逐漸加寬，進而達到分離之目的。增加管柱長度將提高分離效果（即解析度增加）；但相對地隨著層析時間的增加，蛋白質色帶隨擴散作用也會持續加寬，此現象則會降低解析度。以圖中為例，蛋白質A可完全與B和C分離，但B與C之間則因擴散現象而無法達到完全分離的效果。在陽離子交換管柱層析法（cation-exchangechromatography）中（圖3-17a），固相基質是帶負電荷基團。大小-排除層析法（size-exclusionchromatography），也稱為膠體過濾法（gelfiltration，圖3-17b），是利用蛋白質大小之差異進行分離。親和性層析法（affinitychromatography）則利用蛋白質結合親和力之差異加以分離（圖3-17c）。p.90圖

3-17(a)

p.89圖3-17蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。(a)離子交換層析法是利用蛋白質在特定pH值時之靜電荷差異進行分離。圖

3-17(b)

p.89圖3-17蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。。(b)大小-排除層析法（也稱為膠體過濾法或是分子篩過濾法）是利用蛋白質大小之差異進行分離。圖

3-17(c)

p.89圖3-17蛋白質純化常用的三種管柱層析方法。

(c)親和性層析法是利用蛋白質與固定相基質上連接之特殊配位基間結合專一性能力之差異進行分離。在內文中將對此方法做進一步詳細介紹。最新改良的層析法是高效能液相層析法（highperformanceliquidchromatography；HPLC）。此方法利用高壓幫浦，搭配填充可抵抗高壓流動下造成之碎裂力的高品質層析介質，以提高蛋白質分子在管柱中移動的速度。隨著每個純化步驟的完成，蛋白質樣品含量與體積通常會隨之減少（表3-5），此時較適合以更複雜（且較昂貴）的管柱層析法加以分離。p.90表3-5

p.91範例3-1胜肽的離子交換一位生物化學家想要利用離子交換管柱層析法分離兩條胜肽。在這支管柱移動相的pH值下，胜肽（A）的淨電荷為－3，這是因為其含有的Glu與Asp殘基比ArgLys及His殘基多；而另一條胜肽（B）的淨電荷則為＋1。請問哪一條胜肽在陽離子基質中先被沖提下來；而哪一條胜肽則是在陰離子基質中先被沖提下來？p.90範例3-1(續)解：在陽離子基質中帶有負電荷會與陽離子分子結合，進而阻滯陽離子分子在管柱中的行進。而帶有正淨電荷的胜肽（B）和胜肽（A）相比會與陽離子基質有較強的作用，因此，在陽離子交換管柱中胜肽（A）將會先被沖提下來。相對的，在陰離子交換管柱中胜肽（B）會先被沖提下來，因為帶有負淨電荷的胜肽（A）會與帶正電荷的基質作用而被滯留。p.90蛋白質可利用電泳分離與鑑定另一種用以分離蛋白質的重要技術是基於帶電蛋白質分子在電場中之移動，此過程稱之為電泳（electrophoresis）。蛋白質電泳最常使用之膠體介質為聚丙烯醯胺之共價聯結聚合物（圖3-18）。電泳中負責移動大分子蛋白質的是電位能E，泳動率μ是該粒狀分子之速度V與電位能之比值。泳動率也等於該分子之靜電荷

Z與摩擦係數f（此值部分反應出蛋白質之形狀）之比值。可以下式表示：p.91FIGURE1-13

p.91圖3-18電泳。(a)將不同樣品注入聚丙烯醯胺膠體上方之樣品槽中，通以電流後蛋白質樣品將進入膠體中。膠體不但將輕微的溫度梯度引起之對流流動降至最小，而且可以確保蛋白質的移動完全是由電場所驅動。圖3-18(a)

FIGURE1-13

p.91圖3-18(b)

FIGURE1-13

p.91圖3-18電泳。(b)電泳完成後，可利用如Coomassieblue等呈色劑（與蛋白質結合但不與膠體結合）加以處理，使蛋白質色帶呈色而能以肉眼觀察。每一個色帶均代表一種不同的蛋白質（或蛋白質次單元）；小分子蛋白質在膠體中泳動之速度較大分子快，因此會出現於較接近膠體底部處。圖中所示為大腸桿菌RecA蛋白（將在第25章介紹）的純化。由於RecA蛋白的基因已經被選殖於質體中（見第9章），因此它的蛋白表現（即蛋白質的合成）是可以被控制的。第一行顯示的為一組標準樣品蛋白（已知分子量）作為分子量標識。下兩行顯示在大腸桿菌誘導合成RecA蛋白的前後結果。第四行顯示出在粗細胞萃取物中含有的蛋白。接下來幾行（從左至右）表示蛋白質經過各種純化步驟後的結果，從最右行可以看到最終純化出的蛋白為單一條多肽鏈（分子量約38,000）。圖3-18(b)(續)

一般用來概估蛋白質分子量與純度之電泳法會使用到清潔劑十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate；SDS）。在與經同一電泳膠體分離之已知分子量蛋白質標準品比較後，任一未知蛋白質均可由其在膠體上所在之位置計算出其概估之分子量（圖3-19）。p.92FIGURE1-13

p.92圖3-19

FIGURE1-13

p.92圖3-19估算待測蛋白質之分子量。蛋白質在SDS聚丙烯醯胺膠體電泳中之泳動率與其分子量大小有關。(a)已知分子量之蛋白質標準品經電泳分離如第一行所示，這些樣品蛋白質可用來估算未知蛋白質之分子量（第二行）。(b)以分子量之對數值對相對電泳泳動率作圖可得到一線性關係，如此即可在圖中讀取未知蛋白質之分子量。圖3-19(續)

等電焦集法（isoelectricfocusing）是一種用以計算蛋白質等電點（pI）的電泳方法（圖3-20）。當置入蛋白質混合物進行電泳分析時，每一種蛋白質均會泳動到恰等於本身等電點之pH值所在（表3-6）。將等電焦集法與SDS電泳組合而成之實驗流程稱為二維電泳（two-dimensionalelectrophoresis）。此方法用於分析複雜蛋白質混合物時可大幅提高其解析度（圖3-21）。p.92FIGURE1-13

p.93圖3-20

FIGURE1-13

p.93圖3-20等電焦集法。利用蛋白質之等電點差異進行分離。先添加適當兩性電解質以製備穩定的pH梯度之膠體，待測蛋白質混合樣品則置入膠體中之樣品槽，通以電流後各種蛋白質則進入膠體並開始緩慢移動；當移動到與其pI值相同之pH值才停止。記得！當pH＝pI時，蛋白質的淨電荷為零。圖3-20

表3-6

p.93FIGURE1-13

p.93圖3-21

圖3-21二維電泳。(a)蛋白質樣品先以柱狀之等電焦集法進行第一次分離，爾後將此柱狀膠體水平置於平板狀膠體上進行SDS聚丙烯醯胺膠體電泳分析。完成後所得到之膠體，水平方向是依蛋白質之不同等電點進行分離，垂直方向則依蛋白質分子量大小差異進行分離。(b)以二維電泳技術可以解析出超過1,000種大腸桿菌中之蛋白質。未經分離之蛋白質亦可被定量進行蛋白質純化必須有合適的方法，可針對各步驟中存在於許多雜蛋白中之某種特定蛋白質進行偵測與定量。我們必須知道(1)催化全反應之方程式、(2)定量基質消失或產物生成之分析方法、(3)酵素作用時是否需要輔因子如金屬離子或輔酶的參與、(4)酵素活性與受質濃度之關係、(5)最適pH值與(6)酵素保持穩定與最高活性的溫度範圍。p.93一般國際單位中認定，1.0單位之酵素活性定義為：在最適分析條件與25℃下，每分鐘催化1.0μmol基質轉換之速率。活性（activity）是指溶液中的總酵素單位數，比活性（specificactivity）則是每毫克總蛋白之酵素單位數（圖3-22）。比活性可用以評估酵素純度，隨著純化步驟逐步提升，酵素完全純化後會達到最大恆定值（表3-5）。運輸蛋白可分析其與被運輸物質間之結合能力；激素與毒素則可測定其產生之生物效應，如生長激素會刺激特定培養細胞之生長。p.94總結3.3蛋白質可利用其性質之差異加以分離與純化。蛋白質可藉由添加特定鹽類作選擇性的沉澱；各種層析方法是利用蛋白質的大小、親和力、帶電性與其他性質加以純化，包含離子交換層析法、大小-排除層析法、親和性層析法與高效能液相層析法等。電泳是利用蛋白質之質量與帶電荷大小將之分離，SDS膠體電泳與等電焦集法可分別使用，或組合使用（二維電泳）以達到更高之解析度。所有純化步驟都需要一個蛋白質分析與定量方法來偵測蛋白質混合物中特定蛋白質之存在。酵素純化的過程可用比活性分析監測。p.943.4蛋白質的結構：一級結構p.95蛋白質結構一般被定義成四個層級（如圖3-23）。以所有連結胺基酸殘基的共價鍵（主要為胜肽鍵與雙硫鍵）來表示一條多肽鏈的方式稱為一級結構（primarystructure）。一級結構最重要的組成元件就是胺基酸殘基的序列。二級結構（secondarystructure）指部分穩定排列的胺基酸殘基被提高層級成為重複使用的結構模型。三級結構（tertiarystructure）則是描述一條多肽鏈在三度空間中的摺疊方式。當一個蛋白質具有兩個以上的多肽次單元時（即含有兩條以上的多肽鏈），這些次單元在空間中的排列方式即稱為四級結構（quaternarystructure）。FIGURE1-13

p.95圖3-23

圖3-23在蛋白質中結構的層級。一級結構是由藉由胜肽鍵與雙硫鍵連結在一起的胺基酸序列所組成，而所形成的多肽可以再被編排成二級結構的單元。例如：α螺旋。此螺旋則是多肽摺疊成三級結構中的一部分，而三級結構則為多次單元蛋白形成四級結構中的一個次單元。此圖例為血紅蛋白。蛋白質之功能決定於其胺基酸序列大腸桿菌可製造超過3,000種不同蛋白質，人類則能製造約25,000種不同蛋白質。在細菌及人類的例子裡，每一個蛋白質均具有一個獨特的立體構造，而此結構也決定了獨特的功能。每一種蛋白質也都具有獨特的胺基酸序列。推測人類蛋白質中約有20%至30%之蛋白質是具有多形性的（polymorphic），亦即在不同人類族群中，其胺基酸序列會有差異存在。p.95數以百萬計之蛋白質其胺基酸序列已訂定FrederickSanger訂出胰島素多肽鏈之胺基酸序列（圖3-24）。DNA中的核苷酸序列與蛋白質中的胺基酸序列是有些許關聯性的。目前有非常多蛋白質序列是由快速增加的基因體資料庫中之DNA序列間接推衍而得，但仍有許多是以傳統定序方法得到的，這樣的方法可以發現這個基因序列的細節，像是在蛋白質合成後所發生的修飾現象。p.96FIGURE1-13

p.96圖3-24牛胰島素之胺基酸序列。兩條多肽鏈以雙硫鍵加以聯結。A鏈之序列在人類、豬、狗、兔及抹香鯨中是完全相同的；B鏈則在牛、豬、狗、山羊與馬中完全相同。圖3-24

短多肽可利用自動儀器進行定序目前有許多方法可用來分析蛋白質之一級構造，也有許多方法可標定或辨識胺基端胺基酸殘基（圖3-25a）。p.96若欲定序整條多肽，最常被使用的化學性方法，是由PehrEdman所開發出來的。艾德曼降解法（Edmandegradation）只會對胜肽之胺基端殘基加以標定並移除之，其餘所有肽鍵仍均保持完整（圖3-25b）。目前艾德曼降解法可在一種稱為蛋白質定序儀（sequenator）上進行，機器會將各步驟所需試劑以正確比例確實混勻、分離且決定產物，並記錄結果。利用艾德曼降解法準確定序之多肽長度是由每個個別化學步驟的效率決定的。p.97p.97圖3-25

大分子蛋白質須先經片段化後始能完成定序胺基酸定序之效率通常隨著多肽長度增加而遞減。蛋白質中非常長的多肽必須先打斷成小片段後才能有效地進行定序。蛋白質會先以化學或酵素方法切割成數個特定的片段。如果有雙硫鍵存在，必須先將其打開。每個片段都需分別純化後再以艾德曼降解法進行定序。最後，各片段出現在原始蛋白質中之順序將排列好，並決定出雙硫鍵所在之位置。p.98打斷雙硫鍵雙硫鍵的存在會干擾定序的進行。雙硫鍵也會干擾多肽以化學或酵素方法切割的過程。兩種將雙硫鍵不可逆打斷的方法如圖3-26所示。p.98FIGURE1-13

p.98圖3-26

FIGURE1-13

p.98圖3-26打斷蛋白質中之雙硫鍵。圖中所示為兩種常用的方法：以過氧甲酸處理可將胱胺酸氧化成兩個磺基丙胺酸殘基；以二硫蘇糖醇處理則可將胱胺酸還原成兩個半胱胺酸殘基，再進一步以碘乙酸將反應性強的游離硫醇基進行乙基化反應，以避免其再次氧化回復形成雙硫鍵構造。圖3-26

切割多肽鏈有幾種方法可用來片段化一條多肽鏈。蛋白酶（proteases）可催化肽鍵之水解切割，有些蛋白酶只切割連接在