饲料中异噻唑啉酮类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 编制说明

1《饲料中异噻唑啉酮类化合物的测定液相色谱-串联质谱法》编制说明（公开征求意见稿）唑啉酮类药物的测定液相色谱-串联质谱法》国家标准制定工作（计划号：），服液）中检出噻霉酮（1,2-苯并异噻唑啉-3-酮，BIT，C），份饲料添加剂中检出甲基氯异噻唑啉酮（5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，CIT，号：2682-20-4）。2023年，于7份饲料添加剂和复合添加剂预混合饲料中再次表12023年异噻唑啉酮类药物的检出情况2料肝病死亡[3-6]，部分国家或地区已对农药、化妆品等多种产品中异噻唑啉酮类药定BIT最大残留限量（MRL）为0.05～0.5mg/kg。GB9683NOSNOS（ab）图13种异噻唑啉酮类药物结构式：（a）甲基异噻唑啉酮（MIT）；（b）甲基氯异噻唑啉酮（CIT）；（c）噻霉酮（BIT）2024年1月，上海市动物疫病预防控制中心（上海市兽药饲料检测所）、表2标准编制组成员与分工姓名职称承担任务黄士新推广研究员项目主持人，负责项目的全面工作曹莹正高级畜牧师标准方法技术论证樊霞研究员文本和编制说明修改完善严凤高级畜牧师文本和编制说明修改完善张婧畜牧师检测方法研究、标准文本和编制说明修改完善吴雨珊助理畜牧师检测方法研究、标准文本和编制说明修改完善吴剑平高级畜牧师标准方法技术验证王博畜牧师样品采集、数据汇总处理商军高级兽医师标准文本和编制说明修改完善李俊研究员文本和编制说明修改完善谷旭研究员文本和编制说明修改完善42023年11月～2023年12月，标准编制组2024年5月，方法经浙江省动物疫病预防控制中心、江苏省兽药饲料质量方法各项技术指标较好，高效液相色谱-串联质谱法的检出限、定量限、标准曲5和编制说明进行了修改完善，形成了标准文提出如下修改意见：1.建议标准名称修改为“饲料中异噻唑啉酮类化合物的测增加精料补充料，并在编制说明中补充相应数据。3.优化基质匹配标准系列溶液线性范围。4.补充添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂的高浓度（5000意见1：建议标准名称修改为“饲料中异噻唑啉酮类化合物的测定液相色甲基氯异噻唑啉酮（CIT）、噻霉酮（BIT）均为异噻唑啉酮类化合物。原标准名6此，根据专家建议将标准名称修改为“饲料中异噻唑啉酮类化合物的测定液相料中三种异噻唑啉酮类化合物的测定，标准适用具体结果见“2.1线性范围”。添加剂的高浓度（5000µg/kg）添加回收试验，具体结果见“2.6添加剂预混合7GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：2制定后的方法性能够满足相关饲料标准和饲料质量安全监3制定后的方法性具科学性、可靠性及普遍本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的一级水。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶200g，按照GB/T20195制备样品，粉碎后过0ESI+离子化模式下，采用液相色谱-串联质谱仪测得各目标物碎片离子情况选择响应较高的116.1>71.0和116.1>101.1作为MIT的定性离子对，其中8图2异噻唑啉酮类药物的二级碎片质谱图a）MITb）CITc）BIT依次优化液相色谱-串联质谱上鞘气、辅助气、扫吹气、电离电压、源温度——采集模式：多反应监测模式（MRM采集离子对信息见表39表3采集离子对信息注：带“*”为定量离子对。表4液相梯度洗脱程序时间流速（mL/min）A相水B相甲醇（%）06.57.47.50.37070703090903030图3不同流动相色谱图（a）乙腈：水=30:70（V:Vb）甲醇：水=30:70（V:Vc）乙腈：0.01%甲酸=30:70（V:Vd）乙腈：0.05%甲酸=30:70（V:Ve）乙腈：0.1%甲酸=30:70（V:V）考虑到饲料基质复杂的情况，在方法研制过程中，实验比较了WatersHSS18图4不同流动相色谱图a）WatersHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)色谱柱b）PhenomenexKinetexXB-C18（100mm×2.1mm，2.6μm）色谱柱c）WatersACQUITYBEHC18(100mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；（d）AgilentSB-C18(100mm×3.0mm,1.8μm)参考优化后的色谱柱和流动相，确定液相条件如下。色谱柱：图5基于SB-C18柱的标准品（异噻唑啉酮类化合物浓度15ng/mL）离子质量色谱图实验向空白维生素预混合饲料添加剂基质中添加3种异噻唑啉酮类化合如表5所示，结果表明，当提取剂有甲醇时，饲料中MIT的提取效率较低；当采用乙腈提取时，提取效率最优。因此，实验表5不同提取剂对饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的提取效率（n=3）水在高于20mL后提取效果不再提升，故选择20mL提取液。再分别将10mL、表6不同提取剂对饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的提取效率（n=3）5表7不同提取剂时间对饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的提取效率（n=3）5），率大体越来越差。同时，氮吹后的目标物标准品若超过30min未及时复溶，则MIT和CIT的回收率会进一步降低。以上结果说明，MIT和CIT可能易在高温图6氮吹水浴加热不同温度下的影响mg/3mL）及使用前对HLB加入3mL甲醇淋洗活化（后称为“活化H药物不能很好在柱上保留，部分被洗脱导致损失；当使用EMR时，MIT和BIT回收率较低；当使用HLB（60mg/3mL）或活化HLB（60mg/3mL）时，BIT回收率较低，因此均不采用。当采用直接稀释法、PrimeHLB（60mg/3mL）和和重现性更好，因此，实验选择PrimeHLB（60mg/3mL）表8不同净化条件对饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的提取效率（n=3）基质效应可通过公式ME（%）=基质溶液中分析物峰面积/纯溶剂中分析物ME低于85%时，则认为基质对目标化合物的响应产生抑制作用；当ME高于115%时，则认为基质对目标化合物的响应存在增强作用。如图7所示，目标药图7不同饲料基质对目标药物的基质效应表9不同饲料基质中目标物基质匹配标准溶液的线性方程、线性范围、相关系数r2图8空白饲料试验色谱图（a）空白配合饲料b）空白浓缩饲料c）空白添加剂预混合饲料；（d）空白混合型饲料添加剂图9配合饲料添加试验色谱图（a）配合饲料中添加10μg/kgb）配合饲料中添加30μg/kg图10浓缩饲料添加试验色谱图（a）浓缩饲料中添加10μg/kgb）浓缩饲料中添加30μg/kg图11添加剂预混合饲料添加试验色谱图（a）添加剂预混合饲料中添加10μg/kgb）添加剂预混合饲料中添加30μg/kg图12混合型饲料添加剂试验色谱图（a）混合型饲料添加剂中添加10μg/kgb）混合型饲料添加剂中添加30μg/kg~~表10配合饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）批内RSDRSD123123121.02.63.31.11.43.63123123190.322312316.23.623123表11浓缩饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）率RSD123123123123123123表12添加剂预混合饲料中三种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）12312312312312312377.5279.1787.8573.9572.7785.211231231237.38.16.69.89.28.8表13混合型饲料添加剂中三种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）123123123123123123123123123取配制好的标准储备溶液（1mg/mL）于-1于2℃~8℃保存，分别在刚配制完、1个表14标准储备溶液稳定性试验结果36表15标准工作溶液稳定性试验结果药物名称相对偏差RD%13酯、丙酮、酸性甲醇和碱性甲醇进行提取来表16不同提取剂对精料补充料中目标药物的提取效率（n=3）水//提取后，准确取上清2mL分别考察以下方法净化效果：HLB（60mg/3mL）、采用PrimeHLB（60mg/3mL）作为净化用的固相色谱小柱效果更优。综表17不同净化条件对精料补充料中三种异噻唑啉酮类化合物的净化效果（n=3）//表18不同饲料基质中目标物基质匹配标准溶液的线性方程、线性范围、相关系数r2图13精料补充料试验色谱图（a）空白精料补充料b）精料补充料中添加10μg/kgc）精料补充料中添加30μg/kg~~结果均符合GB/T23182-2008《表19精料补充料中三种异噻唑啉酮类化合物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）123123123123123123123123123分别向空白的添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中添加高浓度（5000µg/kg）的三种目标物对照品，每个浓度平行测定5次，计算平均回收率及相对标准偏差（RSD）。如表20所示，添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中三表20添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中高浓度目标物的加标回收率及相对标准偏差（n=5）12312312经上述方法学验证，液相色谱-串联质谱法的线性范围为0.25~50ng/mL，不同类饲料中三种异噻唑啉酮类药物各浓度的批内回收率在61.65%~106.60%添加剂预混合饲料及混合型饲料添加剂中三种和GB/T20195《动物饲料试样的无药使用。国标委下达的制定计划：饲料中异噻唑啉酮类药异噻唑啉酮（CIT）、噻霉酮（BIT）均为异噻唑啉酮类[1].王磊,武绍峰与顾学斌,异噻唑啉酮类杀菌剂的应用研究.工业微生物,2015.45(05):第60-64页.[2].曲振斌,异噻唑啉酮类杀菌剂的应用探究.化工设计通讯,2016.42(09):第103页.[3].马黎等,甲基异噻唑啉酮在健康人群和化妆品接触性皮炎患者中引起皮肤反应的限量研究.中国中西医结合皮肤性病学杂志,2021.20(01):第24-27页.[4].吕鹏等,甲基异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和机制研究.生态毒理学报,2017.12(05):第260-269页.[5].Aerts,O.,etal