GB∕T 40472-2021 柱锈菌科实时荧光PCR检疫鉴定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01柱锈菌科实时荧光PCR检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40472—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌鲁木齐海关。1柱锈菌科实时荧光PCR检疫鉴定方法本文件适用于携带柱锈菌科病菌的植物及其产品中柱锈菌科病菌的检测筛查。本文件没有规范性引用文件。本文件没有需要界定的术语和定义。柱锈菌科基本信息参见附录A。6仪器和试剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/L,EDTA,2GB/T40472—2021醇、次氯酸钠、核糖核酸酶(RNase)、实时荧光PCR反应预混液：2×TaqManUniversalPCR7检疫鉴定挑取感病材料放置在2mL离心管内，加入100μL左右无菌水混匀并震荡1h,获得疑似植物样品。7.2核酸的制备DNA提取方法按照附录B中B.1的要求执行。7.3DNA纯度与浓度的测定用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值(计为OD260和OD280)。DNA的纯度OD260/OD280比值应为1.7OD260(pg/mL)。DNA的浓度与纯度应符合实时荧光PCR检测的要求。7.4实时荧光PCR检测实时荧光PCR按照B.2～B.4的方法检测。以疑似样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据。9样品保存与复核保存植物样品应烘干之后置于2℃~8℃冰箱妥善保存，对送检的样品应至少保存6个月，以备复实时荧光PCR检测阳性结果的照片。由指定的单位或人员负责，主要考察实验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性3玄参科(Scrophulariaceae),萝摩科(Asclepiadaceae),龙胆科(Gentianaceae),芍药科(Paeoniaceae),壳斗科(Fagaceae),杨梅科(Myricaceae)和檀香科(Santalace[C.harknessii,synonymofEndocronartiumharknessii(J.P.Moore)Hirats.]。4GB/T40472—2021(规范性)DNA提取方法及实时荧光PCR检测方法B.1DNA提取方法将灭菌的钢珠放在收集样品的2mL离心管中，将处理过的疑似植物样品加入400μL2×CTAB异戊醇混合液(24:1),均匀混合3min后，12000r/min离心15min,取上清液至另一离心管中；加入等体积三氯甲烷和异戊醇混合液(24:1),轻轻颠倒混匀，12000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中；向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4℃或-20℃沉淀1h,12000r/min50μL无菌水或TE缓冲液(10mmol/LTris.HCl,1mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，-20℃贮存B.2引物及探针序列正向引物Cro-F:5'-GCACTTTATTGTGGCTCTAAACCTT-3';反向引物Cro-R:5'-AACGTACTGTTGAGATGCTATACCAAA-3';探针Cro-P:5'-FAM-CAAAGTTGTTATGTGTGCCTT-MGB-3';探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。B.3扩增体系后置于荧光PCR仪中进行反应。以含柱锈菌科的DNA作阳性对照、不含柱锈菌科的DNA作阴性对B.4扩增反应条件注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数做适当调整。5GB/T40472—2021[2]景耀，王培新.马尾松疱锈病菌及转主寄主研究[J].真菌学报，1988,7:112-115.[3]中华人民共和国农业部公告第862号(2007).中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录.[4]AimeMC(2006).Towardresolvingfamily-[5]AimeMC,CastleburyLA,AbbasiM,BegerowD,BerndtR,KirschnerR,MarvanováL,OnoY,PadamseeM,SchollerM,TnamesinPucciniomycotinaandUstilaginomycotina(Basidiomycota)andIMAFungus,9:75-89.[6]CumminsGB,HiratsukaY(2003).Illustratedgeneraofrustfungi,3rdedn,AmericanPhy-topathologicalSociety,[7]FarrDF,RossmanAY(2019).FungalDatabases,U.S.NationalFungusCollections,ARS,USDA./fungaldatabases/.AccessedFebruary2019.[8]HiratsukaY(1995).Pinestemrustsoftheworld-frameworkforamonograph,Proceedingsofthe4thIUFRORustofPinesWorkingPartyConference,Tsukuba,1-8.[9]LaundonGF(1976).Peridermium(fungi).Taxon,25:186-187.[10]KirkPM,CannonPF,MinterDW,etal.(2008).Dictionaryofthefungi,10thedn.CABI,Wallingford,UK.[11]PetersonRS(1967).ThePeridermicalClub,94:511-542.[12]PetersonRS(1973).StudiesofCronartium(Uredinales),ReportsoftheTottoriMycologi-calInstitute,10:203-223.[13]PetersonRS,JewellFF(1968).StatusofAmericanstemrustsofpine,AnnualReviewofPhytopathology,6:23-40.[14]QiXH,CaiL,ZhaoP(2019).Quasipucciniastrumagrimoniae,gen.etsp.nov.onAgrimonia(Rosaceae)fromChina.Mycology,10:1-10.[15]