生命的奥秘基因治疗专家讲座

生命奥秘

AJourneyintoLife

上海大学生命科学学院生命的奥秘基因治疗专家讲座第1页基因治疗失明基因治疗生命的奥秘基因治疗专家讲座第2页

基因治疗基本概念

基因治疗发展历程

基因治疗策略基因治疗流程基因治疗应用内容生命的奥秘基因治疗专家讲座第3页约3万个基因

人类30亿对碱基

(98％调控序列,2％信息序列)

约20万种蛋白质

基因组学

蛋白质组学

基因：编码蛋白质和RNADNA序列。生命的奥秘基因治疗专家讲座第4页“bubbleboy”生命的奥秘基因治疗专家讲座第5页基因治疗案例分析

成功案例第一例正式同意基因治疗：先天性腺苷脱氨酶

（adenosinedeaminase,ADA）缺乏症基因缺点严重联合免疫缺点症(SevereCombinedImmunodeficiency,SCID)

常染色体隐性遗传病生命的奥秘基因治疗专家讲座第6页SCID患者

梦

住在休斯敦得州儿童医院隔离泡泡里。Bubbleboy:DavidVetter(1971-1984)

六岁时第一次走出了泡泡。隔着泡泡上课。David和他姐姐Katherine生命的奥秘基因治疗专家讲座第7页ADA缺失SCID

T,B淋巴细胞缺点

成熟T细胞成熟 B细胞生命的奥秘基因治疗专家讲座第8页ADA缺点→→脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻→dATP↑ATP↑→抑制核糖核苷还原酶活性→阻止DNA复制和修复→T、B淋巴细胞增殖障碍。腺苷脱氨酶(ADA)

影响代谢路径生命的奥秘基因治疗专家讲座第9页1990年9月14日人ADA基因自体白细胞

患SCID4岁女孩第一例成功基因治疗逆转录病毒载体美国国家心肺和血液研究所WilliamF.AndersonMichaelBlaeseKennethCulverAshantiDeSilvaADA恢复至正常水平5%-10%维持免疫系统改进症状Moloneymurineleukemiavirus生命的奥秘基因治疗专家讲座第10页年AshantiDeSilva21岁，仍生存良好6岁照片AshantiDeSilvaBubblegirl离开无菌仓1991年，另一位SCID11岁女孩CindyKisik，接收了完全相同基因治疗，取得成功。年，DeSilva（左）/Kisik（右）和Blaese医生合影。生命的奥秘基因治疗专家讲座第11页策略：将淋巴细胞ADA酶恢复至正常5-10%，维持免疫系统功效，改进病人症状。ADA缺乏基因治疗策略和步骤步骤1）血液中单个核细胞分离。2）单个核细胞体外培养增殖。3）载体介导外源基因转染T细胞；4）将转染细胞回输给患儿体内。生命的奥秘基因治疗专家讲座第12页为何选择ADA缺点症？发病机理明确单个基因缺点引发疾病；基因表示调控简单；基因过量表示无害，低表示也能足以治愈SCID。生命的奥秘基因治疗专家讲座第13页一、基因治疗基本概念基因治疗：把基因转移到患者体内，使其发挥作用，以到达治疗疾病目标。经典：指正常基因整合入细胞基因组，校正或置换致病基因一个治疗方法。广义：改变基因结构与功效，以到达治疗疾病目标方法。生命的奥秘基因治疗专家讲座第14页基因治疗基本标准“隐性”遗传疾病，导入正常基因即可纠正缺点；正常基因已克隆，能表示有功效产物；治疗基因体内表示无需准确调控，表示产物过多无害；外源基因细胞，能自然消减，不成瘤，不产生额外病毒。生命的奥秘基因治疗专家讲座第15页生殖细胞(germline)基因治疗只限某一体细胞基因改变只限于某个体当代对缺点生殖细胞进行矫正当代及子代体细胞(somaticcell)基因治疗长久影响不明，且包括伦理学问题生命的奥秘基因治疗专家讲座第16页二、基因治疗发展历程“改变基因缺损：医疗美好前景”

——N.Engl.J.Med(1968)MichaelBlaese

准备期（1980年-1989年）

狂热期（1990年-1995年）

理性期（1996年至今）生命的奥秘基因治疗专家讲座第17页1980年，人β地中海贫血患者基因治疗，没取得好疗效，也无不良反应。1989年，首个获批基因治疗，将细菌新霉素抗性基因neoR导入肿瘤浸润淋巴细胞，回输患者体内，

细胞存活了两个月。1.准备期：1980年-1989年

肿瘤浸润淋巴细胞（TIL,tumorinfiltratinglymphocyte）生命的奥秘基因治疗专家讲座第18页2.狂热期：1990年-1995年

1990年9月——SCID患者首例成功基因治疗

AshantiDeSilva，显微注射ADA基因到淋巴细胞后再输回患者体内，四年后测得取得了正常人1/4免疫球蛋白。1999年第1个获基因治疗德谢尔瓦13岁。生命的奥秘基因治疗专家讲座第19页法国巴黎奈克儿童医院费舍尔博士与卡波博士也对两例先天性免疫功效不全患儿成功地进行了基因治疗。狂热期，在短短几年内有100多个方案取得同意进入临床试验。1991年，我国首例基因治疗B型血友病取得成功。生命的奥秘基因治疗专家讲座第20页中国第一例基因治疗1991年12月上海研究结果：血中凝血因子IX水平升高，症状缓解人凝血因子

IX基因

皮肤成纤维细胞

患血友病B

9岁和14岁男孩评价：中国第一例成功基因治疗，是世界第二例逆转录病毒载体复旦大学遗传学研究所&长海医院薛京伦教授血友病B，即因子Ⅸ缺乏症，X性染色体隐性遗传疾病生命的奥秘基因治疗专家讲座第21页3.理性期：1996年-至今1995年评定，100多项基因治疗中，仅有几项确证有疗效。多角度对基因治疗进行全方面研究。生命的奥秘基因治疗专家讲座第22页载体安全性1999年9月UniversityofPennsylvania腺病毒引发强烈免疫反应，患者4天后死亡。

JesseGelsinger

鸟氨酸甲酰基转移酶基因患OTC缺点病

18岁男孩

腺病毒载体

动脉注射至肝脏鸟氨酸甲酰基转移酶缺乏症是一个X连锁隐性遗传尿素循环疾病，氨中毒。生命的奥秘基因治疗专家讲座第23页Wilson第二代腺病毒载体出现剔除E1,E3,降低腺病毒抗原性腺病毒基因组结构与载体改造E1：病毒复制、包装、反应，强细胞毒性E2：DNA复制，E3:反抗宿主。ψ包装信号，ITR末端倒转重复序列生命的奥秘基因治疗专家讲座第24页第三代腺病毒相关表示载体穿梭载体腺病毒DNA重组腺病毒在工程菌中，基因同源重组合成重组腺病毒载体在HEK293细胞中重组载体包装为病毒生命的奥秘基因治疗专家讲座第25页世界首个上市基因治疗产品深圳赛百诺企业CEO彭朝晖

年10月16日，重组人p53腺病毒注射液(Gendicine,今又生)取得国家食品药品监督管理局同意新药证书。生命的奥秘基因治疗专家讲座第26页1012个p53重组腺病毒颗粒(VP)

零售价为3380-3980元使用方法:放疗前瘤内注射，1支/周，1疗程4支每支:用途:治疗头颈部肿瘤等

今又生82名鼻咽癌患者组别对照组试验组人数40名42名治疗放疗放疗＋今又生五年生存率59.2%66.7%五年无病生存率57%68.7%7.5%11.7%

生命的奥秘基因治疗专家讲座第27页基因治疗现实状况年临床试验数目1843项生命的奥秘基因治疗专家讲座第28页疾病种类基因种类生命的奥秘基因治疗专家讲座第29页年9月16日3654例基因治疗临床试验/生命的奥秘基因治疗专家讲座第30页三、基因治疗策略基因置换(genereplacement)基因增补(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)正常基因经过同源重组置换致病基因

单基因遗传病

导入正常基因，与致病基因共存

导入原本不表示基因(自杀基因等)

单基因遗传病肿瘤

导入反义RNA,siRNA,miRNA,核酶,反义DNA

生命的奥秘基因治疗专家讲座第31页1.基因置换将特定目标基因导入特定细胞，经过定位重组，以导入正常基因置换基因组内原有缺点基因。

对缺点基因缺点部位进行准确原位修复，不包括基因组任何改变。

同源重组基因靶向载体阳性筛选记号阴性筛选记号基因组DNA修饰后基因组DNA移除基因组部分插入基因组部分同源位点生命的奥秘基因治疗专家讲座第32页基因置换正常基因经同源重组技术定向替换缺点基因。用胚胎干细胞方法，同源重组率1/100万→提升1/10。*MutatedAllele生命的奥秘基因治疗专家讲座第33页2.基因添加

经过导入外源基因使靶细胞表示其本身不表示基因。在有缺点基因细胞中导入对应正常基因，原缺点基因保留。导入正常基因表示产物，赔偿缺点基因功效；导入靶细胞原来不表示基因，利用其表示产物到达治疗疾病目标。目标位点目标基因基因载体染色体生命的奥秘基因治疗专家讲座第34页将“自杀”基因导入靶细胞基因表示酶能使药品前体转化为细胞毒性代谢物，杀死靶细胞自杀基因治疗生命的奥秘基因治疗专家讲座第35页导入自杀基因

单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(E.coli-CD)基因

旁观者效应5-氟胞嘧啶(5-FC)E.coli-CD5-氟尿嘧啶(5-FU)丙氧鸟苷(GCV)HSV-TKppp-GCV

“自杀基因”治疗不但使转导了“自杀基因”肿瘤细胞相邻未转导“自杀基因”肿瘤细胞也被杀死。为何？生命的奥秘基因治疗专家讲座第36页抑制某个基因表示，或者经过破坏某个基因而使之不表示，以到达治疗疾病目标。3.基因失活

导入反义RNA,siRNA,miRNA,核酶,反义DNA

广义基因治疗生命的奥秘基因治疗专家讲座第37页基因缄默技术

反义DNA：结合靶DNA，封闭其复制与转录。反义RNA：结合靶mRNA，封闭其翻译。

核酶：能自我剪切RNA，锤头、发夹状。小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)：结合靶mRNA，使其降解。核酸免疫系统

微小RNA(microRNA,miRNA)：结合靶mRNA，封闭其翻译。

基因失活生命的奥秘基因治疗专家讲座第38页反义寡聚核苷酸（І类）

与mRNA特异性结合，阻断翻译过程反义寡聚核苷酸阻断特异蛋白合成蛋白生命的奥秘基因治疗专家讲座第39页四、基因治疗流程选择治疗基因受体细胞（靶细胞）选择和培养载体选择将目标基因导入靶细胞转移生命的奥秘基因治疗专家讲座第40页1.选择治疗基因

多基因病（肿瘤、心血管病、糖尿病、肥胖等）

单基因病（一些遗传病）加法：“缺什么补什么”标准(SCID、血友病、镰状贫血)减法：“多什么去什么”标准对致病主导基因做加减法(增补或抑制)

突变基因生命的奥秘基因治疗专家讲座第41页易取和移植。血细胞、肌细胞；寿命长；易受外源基因转化；转染细胞培养后回输，易成活。体细胞生殖细胞×2.受体细胞（靶细胞）选择和培养对生殖细胞进行基因治疗，理论上讲是根治遗传病理想方法，但因为包括安全性和伦理学问题生命的奥秘基因治疗专家讲座第42页当前惯用靶细胞造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞生命的奥秘基因治疗专家讲座第43页3.载体选择将治疗基因高效转移入体内、并调控其适度表示。惯用载体：病毒类和非病毒类。病毒载体：逆转录病毒载体，腺相关病毒载体等；非病毒载体：

脂质体，受体介导等理化方法。基因载体选择要求轻易生产连续表示弱免疫源整合能力能感染分裂期细胞和未分裂期细胞生命的奥秘基因治疗专家讲座第44页粘性末端质粒目标基因粘性末端匹配粘性末端分(分离)切(切割)生命的奥秘基因治疗专家讲座第45页酶切后目标基因片段接(连接)连接后重组质粒DNA分子生命的奥秘基因治疗专家讲座第46页重组质粒目标基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!生命的奥秘基因治疗专家讲座第47页筛(筛选)分解抗生素酶含抗生素培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌生命的奥秘基因治疗专家讲座第48页大量生长提取大量质粒酶切判定生命的奥秘基因治疗专家讲座第49页基因克隆基本步骤分：分离目标基因和载体DNA。切：用适当酶切割上述二者，产生匹配末端。接：连接酶将目标基因装入载体。转：转入宿主细胞。筛：筛选含有重组DNA分子阳性克隆。生命的奥秘基因治疗专家讲座第50页病毒介导基因转移系统

病毒载体介导基因转移效率较高。。生命的奥秘基因治疗专家讲座第51页逆转录病毒生活史基因组是单正链RNA，有逆转录酶，整合染色体生命的奥秘基因治疗专家讲座第52页RNA去向翻译:作为mRNA翻译成病毒蛋白质包装：作为病毒RNA基因组被装配成新病毒颗粒基因治疗用逆转录病毒？生命的奥秘基因治疗专家讲座第53页ψ

LTRgagpolenvLTRLTR:长末端重复序列(Longterminalrepeatsequence)

含增强子、开启子、转录终止信号、PolyA

Ψ:包装信号逆转录病毒结构和基因病毒结构蛋白生命的奥秘基因治疗专家讲座第54页env,pol,gag为活病毒所需基因载体构建时剔除，只保留Ψ包装信号逆转录病毒载体构建生命的奥秘基因治疗专家讲座第55页

包装细胞需稳定表示病毒结构蛋白逆转录病毒载体在包装细胞内复制

重组病毒感染宿主后不再复制

包装细胞复制出大量重组病毒颗粒病毒结构蛋白病毒结构蛋白病毒结构蛋白病毒结构蛋白

包装细胞——重组病毒“工厂”重组病毒核酸Ψ

LTR

LTR治疗基因重组病毒颗粒(复制缺点)

生命的奥秘基因治疗专家讲座第56页LTRφLTR目标基因标识基因134靶细胞LTRLTR目标基因标识基因5逆转录病毒介导基因转移系统逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系2辅病毒

Ψ

包装信号生命的奥秘基因治疗专家讲座第57页4.将目标基因导入

基因转移(genetransfer)技术病毒法：

病毒载体感染靶细胞。非病毒法：物理方法——显微注射、电穿孔等；化学方法——脂质体融合、受体介导内吞作用

生命的奥秘基因治疗专家讲座第58页脂质体介导基因转移示意图缺点：脂质体介导进入靶细胞内，易被单核-吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。生命的奥秘基因治疗专家讲座第59页基因治疗路径间接体内治疗路径（exvivo）取出靶细胞，体外扩增后，将目标基因转入，选择高表示靶细胞扩增后回输直接体内治疗路径（invivo）将目标基因体内直接转移到靶细胞。生命的奥秘基因治疗专家讲座第60页基因治疗两种路径载体目标基因invivoexvivo靶细胞生命的奥秘基因治疗专家讲座第61页5.靶细胞回输方式：静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等。淋巴细胞以静脉注射回输血液；将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织；自体骨髓移植静脉回输血液；以将血管内皮细胞定位输入血管等。生命的奥秘基因治疗专家讲座第62页基因治疗应用遗传病基因治疗肿瘤基因治疗病毒性疾病基因治疗生命的奥秘基因治疗专家讲座第63页

1.遗传病基因治疗单基因缺点疾病仅限体细胞基因治疗靶细胞易获取、培养、及回输体内治疗效果应胜过对病人危害表示水平无需调控且无副作用需经动物试验验证安全可行当前可供选择并符合上述4条以上要求不过只有30余种遗传病生命的奥秘基因治疗专家讲座第64页腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏症珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病血友病和其它血浆蛋白缺乏症苯丙酮酸尿症和其它先天性代谢缺点病莱-纳(Lesch-Nyhan)综合征家族性高胆固醇血症囊性纤维化病当前基因治疗遗传病生命的奥秘基因治疗专家讲座第65页年11月3日，欧盟同意首个基因治疗药品Glybera脂蛋白脂肪酶缺乏症（发病率～1/100万）。接收一次治疗后，可显著降低致死性急性胰腺炎发病率。荷兰UniQure研制，花费将高达125万欧元。生命的奥秘基因治疗专家讲座第66页，11月6日，FDA同意SparkTherapeutics基因治疗产品SPK-RPE65。利伯氏黑蒙症（Leber’scongenitalamaurosis）

RPE65基因突变致视网膜营养不良致盲。21病人能够对感觉到光，几位经三年治疗已复明。治疗费用$100,000/位。使用AAV单次注射眼睛生命的奥秘基因治疗专家讲座第67页视网膜退化小鼠模型里。将视紫红质光敏蛋白表示在双极细胞中。利用双极细胞来看到外面世界。无可恢复视网膜治疗方案生命的奥秘基因治疗专家讲座第68页，9月10号，FDA经过了血友病B型（缺乏凝血因子IX）DimensionTherapeutics企业产品生命的奥秘基因治疗专家讲座第69页肿瘤是一类多步骤、多基因突变疾病，这些基因主要是编码调控细胞周期各种蛋白因子基因。2.肿瘤基因治疗癌基因（原癌基因）抑癌基因生命的奥秘基因治疗专家讲座第70页

导入抑癌基因抑制过分表示癌基因导入免疫增强基因(细胞因子、共刺激分子)导入抑制血管生成基因(endostatin等)导入自杀基因

基因缄默技术

肿瘤基因治疗策略生命的奥秘基因治疗专家讲座第71页p53——基因组卫士野生型p53

突变型

p53

抑癌基因癌基因点突变DNA损伤抑制细胞周期开启DNA修复修复失败

修复成功

诱发细胞凋亡

继续细胞周期50%肿瘤相关性（1）导入抑癌基因今又生生命的奥秘基因治疗专家讲座第72页RNAi作用机制经过剪切mRNA或者抑制mRNA翻译，下调靶基因表示水平。（2）抑制过分表示癌基因生命的奥秘基因治疗专家讲座第73页肿瘤相关基因调控网络RNA干扰（RNAi）生命的奥秘基因治疗专家讲座第74页microRNA(miRNA)是一组由基因组编码长度约20～23个核苷酸非编码RNA，经过和靶基因mRNA碱基配对引导缄默复合体(RISC)降解mRNA或妨碍其翻译。转录后负调控基因表示30%基因受到调控MicroRNA动物、植物，甚至在病毒中都发觉miRNA基因。生命的奥秘基因治疗专家讲座第75页miRNA生物合成核内胞浆生命的奥秘基因治疗专家讲座第76页miRNAsAffectEverything©FrankSlackfrank.slack@发育时间分化衰老凋亡代谢癌症生命的奥秘基因治疗专家讲座第77页miRNAsasOncogenesandTumorSupressorsZhangetalDevBiol.Feb1;302(1):1-12癌基因抑癌基因生命的奥秘基因治疗专家讲座第78页NatureMed11(7):713-714,.a：miRNA过分表示，抑制了抑癌基因正常表示；b：miRNA表示过少或缺失，不能有效抑制癌基因。abmicroRNAs经过对抑癌基因和/或癌基因调控与肿瘤发生相关生命的奥秘基因治疗专家讲座第79页DetaoWang,etal.miR-150,p53proteinandrelevantmiRNAsconsistofaregulatory

networkinNSCLCtumorigenesis.OncolRep;30(1):492-498.肺癌生命的奥秘基因治疗专家讲座第80页英国AdaptimmuneTherapeutics多发性骨髓瘤、黑色素瘤