免疫学技术第九章血清学试验概述

第九章血清学试验概述

学习要点:

血清学试验的类型血清学试验的一般特点血清学试验的优越性

血清学试验的制定原则血清学试验的制定原则血清学试验的发展趋向

免疫学检测技术的用途非常广泛，可用于疾病诊断，疗效评价及发病机制的研究。如传染病、免疫增

殖性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、移植排斥反应、肿瘤的免疫学检测，对诊断、治疗均有

很大帮助。

此外，在医学生物学研究中对抗原性物质或细胞的定性、定量检查，不仅推动了对各种免疫学现象的

研究，而且扩大免疫学与医学生物许多领域的联系。

由于抗体主要存在于血清中，所以在体外进行的抗原抗体试验通常采用血清，这些试验称为血清学试

验。

一、血清学试验的类型

由于各种检测方法中所用的抗原抗体性状不同，出现结果的现象以及检测的方法也不同，所以我们通

常将血清学试验分为：

r-免疫荧光技术

Ag-Ab结合后借助理化测试技术使不可见的反应，匚哩统一

等等

厂一级血清学试蛉—标记技术-放射标圮技术

转化为可见反应或可检测的数据对Ag-Ab要求不限。胶体金技术

_铁蛋白标记技术

凝集反应

—凝聚性反应

二级血清学试蛤Ag-Ab结合后经过一定阶段出现凝集、沉淀、细胞溶解等现象；一―沉淀反应

不能用于单价抗原单价抗体的检测.

-溶菌反应

一有补体参与的反应_溶血反应

—血清中和试验补体结合反E

在活细胞或活体内进行的Ag-Ab反应：

一三级血清学试验免疫就附血滤

皮肤试验

专门用于检测中和抗体和过敏性抗体.

被动皮肤试验

二、血清学试验的一般特点

1、特异性与交叉性(SpecificityandCrossReactivity)

(1)特异性：一种Ab只与其相应的Ag决定簇结合，具有高度的特异性

ncnc

CcOn

不索需*

(2)交叉性：不同抗原分子具有相同抗原决定簇；决定簇之间具有相似的构象。

Crossreactions

Similarepitope

2、亲合性与解离性(Affinityandextricability)

Ag-Ab的结合就像酶与底物、激素与其受体的结合•样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合,

既具有亲合性，也具有解离性。抗原决定簇和抗体可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。

亲和力结合常数的计算

3、抗原抗体的结合比例(Ag:Abratio)

Ag:Ab结合需要适当的比例，Ag或Ab过多过少，都不能形成大的Ag-Ab复合物。

Abexcess

Agexcess

Equivalence-Latticefbnnation

4、影响因素(FactorsAffectingAg/AbReactions)

反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基团的解离性和电荷特性有重要的影响。

(1)电解质：常用生理盐水：使用禽类血清时，常用8—10%高渗盐水。

(2)酸碱度：常用pH6~8,过高过低，都可使Ag:Ab复合物解离，如pH降至Ag或AbpI时，可引

起非特异酸凝集。

(3)温度：通常37℃,增加Ag和Ab接触的机会，加速反应的出现。

(TOP)

三、血清学试验的优越性

I、特异性强，敏感性高；2,检样量少，预处理简单；3、试验方法多，功能各异，可择优选用

4、方法简易快速；5、可用于抗原或抗体的定位

四、血清学试验的制定原则

目前已经有许多成熟的血清学试验方法可以借鉴，实际研究中，可根据研究对象的性质和目的，选用

或制定特定的操作规范。

有关内容请同学们自学

五、血清学试验的应用

1、抗原或抗体的快速检测；2、生物活性物质的微量检测；3、抗原或抗体在细胞或亚细胞水平

的定位

4、抗原组成的分析；5、微生物鉴定和抗原分型；6、有机物的提取和纯化；

7、血型鉴定。

六、血清学试验的发展趋向

1、试验的微量化和自动化；2、试剂的标准化和商品化；3、方法的快速简易和标准化

4、试验的敏感、特异和精密化；5、试剂盒的系列化

复习思考题：

1、什么是血清学试验？

2、血清学试验的类型？

3、血清学试验的一般特点？

第十章凝集性试验

学习要点：

凝集试验的概念、原理、分类，以及常用的凝集试验类型。沉淀试验的概念、原理、分类，以及

常用的沉淀试验类型。

由于所用抗原的性状不同，出现的现象也不同：

1、细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性颗粒抗原,当与相应抗体结合，抗原与抗体结合

形成凝集团块，即称为凝集试验(agglutination)。

2、病毒、蛋白质等可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时,可形成较大的不溶性免疫复合物，在

反应体系中出现不透明的沉淀物，称为沉淀反应(precipitationreaction).

第一节凝集试验(agglutinationtest)

细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原，当与相应抗体结合，在有电解质存在时,

抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集试验。凝集试验中的抗原称为凝集原(agglutinogen),抗体称

为凝集素(agglutinin)

一、凝集试验的一般原理

通常，细菌和红细胞等颗粒性抗原在悬液中带弱负电荷，周围吸引一层与之牢固结合的正离子，外面又

排列一层松散的负离子层，构成一个双离子层，使颗粒相互排斥。

当特异抗体与相应抗原颗粒互补结合时，抗体的交联作用克服了抗原颗粒表面的电位，而使颗粒聚集

在一起。

二、凝集试验的发生分两阶段

1、抗原抗体的特异结合；

2、在电解质的参与下，出现可见的凝集颗粒。

三、凝集试验的用途

凝集试验方法简便，敏感度高，因而在临床检验中被广泛应用。

1、可用于定性的检测，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性。

2、也可进行定量检测，即将标本作一系列倍比稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为

滴度。

四、凝集试验的分类

直接凝集试赛

两大类r乳胶凝集试验

间接凝集试睑炭素凝集试验『商重日京蔡知茄I薪/蔡真而所嬴前射嶷莅:1

LI____________________________________________/

间接血凝试验

1、直接凝集试验(directagglutination)

细菌、螺旋体和红细胞等颗粒抗原，在适当电解质参与卜可直接与相应抗体结合出现凝集。

直接凝集反应

。。。+AYY

颗粒性抗原相应抗体

直接凝集试验分为：玻板凝集试验和试管凝集试验。

(1)玻板凝集试验：为定性试验方法

①用已知抗体作为诊断血清、与待检颗粒抗原悬液各加•滴在玻板上，混匀；

②数分钟后即可用肉眼观察凝集结果：出现颗粒凝集的为阳性反应

此法简便、快速，适用于：细菌分离株的鉴定与分型；红细胞ABO血型的鉴定。

(2)试管凝集试验：为定量试验方法

①常用已知抗原液与一系列稀释的受检血清混合；

②保温后观察每管内抗原凝集程度；以产生50%凝集的最高稀释度作为血清中抗体的效价，亦称为

凝集价、滴度。

1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024阳性与阴性对照

样品oooooo@⑨O凝集价

ooo©@@@O64

oooooooO

@®@®©@⑥⑥O

ooooo©⑥O<2

32

。

@®oooo您O

6ooooo®⑥®O128

732

oo@®@®您®O

84

前带现象:瀚集价高的血清在最初的1-2管中往往由于抗体过剩而不出现凝集.

(3)在试验中，由于电解质浓度和pH不适当等原因，可引起抗原的非特异性凝集，出现假阳性反应,

因此必须设不加抗体的稀释液作对照组。

自家凝集

酸凝集

2、间接凝集试验(indirectagglutination)

将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面\然后与相应抗体(或抗原)作用，在适宜

电解质存在的条件卜.，出现的特异性凝集现象。

间接凝集反应

7

载体颗粒可溶性抗原致敏颗粒抗体凝集

(1)正向间接凝集试验：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。

(2)反向间接凝集试验：用特异性抗体致敏载体以检测标木中的相应抗原。

我体颗粒

抗体致敏颗粒

凝集

(3)间接凝集抑制反应：诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致

敏抗原相同的抗原。

也可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体，

此称反向间接凝集抑制反应。

间接凝集试验的作用：具有快速/敏感/操作简便/无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗

体的测定：故在临床检验中广为应用。

间接凝集抑制反应

可溶性抗原抗体致敏颗粒

3、协同凝集试验(coaggoltination)

与间接凝集试验的原理相似，只是所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一

种金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌的菌体细胞壁中含有A蛋白(SPA),SPA具有与IgG的Fc段结合的

特性。因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体；如与相应抗原接触，即出现

反向间接凝集试验。适用于细菌和病毒等的直接检测。

4、抗球蛋白试验(antiglobulintest,coombstest)

抗球蛋白试验的原理为间接凝集试验，主要用于检测单价的不完全抗体或封闭抗体。

+

不完全Ab颗粒性抗原

如：RBCs

Step2

+V=

Anti-AbFc

(TOP)

第二节沉淀试验(Precipitationtest)

可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物，在电解

质存在时,反应体系中出现不透明的沉淀物。

沉淀反应分两个阶段：

第一阶段：抗原抗体特异性结合；第二阶段：形成可见的免疫复合物

经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法；

而快速免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法

一、环状沉淀试验(ringprecipitationtest)

环状沉淀试验是Ascoli于1902年建立的：

将免疫血清加到直径小于0.5cm的反应管底部；将含有可溶性抗原的材料重叠于上；

抗原与抗体在两液界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验。

此法简便易行；兽医上常用于炭疽杆菌抗原的检测。

二、絮状沉淀试验(flocculatonprecipitationtest)

该法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在时，Ag与Ab结合形成絮状沉淀物。

这种沉淀试验受到Ag与Ab比例的直接影响，通常采用固定Ab稀释Ag的方法，Ag与Ab比例适合时，产生反应

最快；Ag过剩或Ab过剩，则沉淀减少，甚至无沉淀。

Ag过剩一前带；Ab过剩一后带。

固定抗体

稀释抗原

OOOO©©OOOOOO

Ag过剩Ab过剩

前带后带

三、免疫比浊法(immunonephelomytry)

当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，能形成一些肉眼看不见的小免疫复合物；可通过液体的光束

发生散射；随着加入抗原增多，形成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。

免疫比浊法就是在一定抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一段时间，用光散射浊度计测量反应

液体的浊度，来推算样品中的抗原含量。

四、免疫扩散(immunodifusion)

1%浓度的琼脂凝胶形成网络状结构，孔径约85nm,抗原和抗体在凝胶内可自由扩散：Ag-Ab复合

物为超大分子，由于网孔的限度，而被网在琼脂中；即使浸泡也只能去除游离的Ag或Ab。

1、单向扩散

该方法由Oudin于1946年报道

(1)单向单犷数(2)单向双扩散

不同浓度的抗原液不同浓•度的抗原液

不

含

抗

体

举洋

A3的

子

球

膈

/\JUUUU

含有抗体的琼脂

2、双向单扩散

(1)将抗体混入加热溶解的琼脂中,倾注于玻片上,制成含有抗体的琼脂板:

(2)在适当位置打孔，将不同稀释度的抗原加入小孔，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的

抗体相遇形成免疫复合物。

Abingel

原浓度1:21:41:8

(3)当复合物体积增大到一定程度时停止扩散，出现以孔为中心的圆形沉淀圈。

关

正相

度成

原浓

的抗

径与

圈直

沉淀

平

板

法阳

㈣

后

坦

归

胶

的凝

抗体

含有

浓度

抗原

扩

验，琼

扩散试

为琼脂

：也称

散试验

向双扩

3、双

和抗体

入抗原

分别放

两孔内

相邻的

(2)在

打孔;

定距离

上按•

琼脂板

在1%

(I)

。

材料

线。

条沉淀

现1〜2

可出

孔间

在两

扩散，

凝胶中

向四周

和抗体

当抗原

(3)

。

性分析

原相关

料的抗

抗原材

于两种

测或用

定量检

定性或

抗体的

抗原或

用于：

本法常

Ag1,30OAg1

z相同

Ab-1

Ag10QAg2.4

/完全不同

Xab-1.2,4

Ag10Q)Ag1.2

/个部分相同

Ab-1,2

五、免疫电泳技术

免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物；其优点就是加快了沉淀反应的速度。

这里仅介绍常用的免疫电泳技术。

1、免疫电泳(immunoelectrophoresis)

是将电泳技术与琼脂扩散相结合的技术，分成两个步骤，即：先进行电泳，再进行琼脂扩散。

+®OOO'®OOO

I仙-

(1)将抗原样品加入琼脂中电泳，将各成分依电泳速度不同而分开；

(2)在适当位置沿电泳方向挖一直槽，于槽内加入含有针对各种抗原混合抗体液:

(3)让各抗原成分与相应抗体进行琼脂扩散;

（4）•定时间后可形成多条沉淀线。

常用此法进行血清的蛋白种类分析；对于免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。

2、对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)

(I)对流电泳的原理

①蛋白质是两性分子:pH<pI时，Pr.带正电；pH>pI时,Pr.带负电。

②一般情况下，抗体和抗原多为蛋白质；当在pH8.2以I：的溶液中，抗体和抗原都带负电；但抗体的

pl比较高，所以抗体带的电荷比较少。

③琼脂本身带SO42-,可通过静电感应使溶液分子带正电；故在电场的作用下，可以形成一种向负极的

推力，我们称之为“电渗”

抗原带的电荷多，所受的电场力可以克服电渗一向正极移动

抗体带的电荷少，所受的电场力不能克服电渗一向负极移动

④对流电泳是在电场作用下的双向免疫扩散，该法敏感快速。

(2)对流电泳的操作方法

①在琼脂板上打两排孔，一侧各孔加入待测抗原，另一侧孔内放入相应抗体，抗原在负极侧，抗体在

正极侧。

Ag]AbiAg2Ab2

•0•0

i0•0+

O000

②将琼脂板放入电泳槽内并通电，带负电荷的抗原向正极侧泳动，而抗体借电渗作用向负极侧泳动。

AgjAbjAg2Ab2

③大约1〜2小时可在中间或抗体的另一侧形成沉淀线。

AgiAg2Ab2

oo•o

oooo+

oooo

④条带形成的形状与抗原抗体泳动的速率有关。

抗原抗体

分子大小

分子构冢

电荷多少

等等

3、免疫火箭电泳(rocketimmunoelectrophoresis)

是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速的单向扩散。

(1)在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；

(2)加入待测抗原后，将抗原置负极端，用2~3mA/cm的电流强度进行电泳；

(3)抗原泳向正极，当抗原抗体比例合适时，形成肉眼可见的沉淀峰；

由于电泳继续进行，样品孔不断有Ag移向Ag-Ab复合物，当Ag过剩时沉淀溶解而在前面又形成

新的Ag-Ab复合物的沉淀峰。

(4)如此反复向前，形成火箭状的沉淀峰；

其沉淀峰高度和Ag的浓度成正比,与同样条件下已知浓度的Ag-Ab比较，即可求得待测的Ag含量。

4、免疫印迹法（immunoblotting,又称为Western-blot）

1、电泳分离

1、经电泳将蛋白质抗原按分子量大小分离；

2、将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上;

3、将硝酸纤维膜浸入第一抗体；

4、将硝酸纤维膜浸入标记的第二抗体；/〜P叭

!\

/亚N

5、加入显色底物（或放射自显随）显现第二抗体.

/P15\

/\

5、加入底物显色

复习思考题：

I、什么是凝集试验？什么凝集原？什么是凝集素？

2、什么是凝集价？

3、凝集试验的分类，以及常用的凝集试验有哪些？

4、什么是协同凝集试验、抗球蛋白试验？

5、什么是沉淀试验？什么沉淀原？什么是沉淀素？

6、琼脂扩散的原理。

7、什么是电渗及其在电泳的作用？

8、免疫电泳和对流电泳的原理？

第十一章免疫标记技术

学习要点:

荧光抗体技术免疫酶技术放射免疫测定免疫胶体金技术化学发光免疫测

定

重点掌握荧光抗体技术免疫酶技术

免疫技术是利用Ag-Ab反应进行的检测方法，特点是具有高度的特异性和敏感性。如将Ag或Ab用

标记物(如荧光素、酶、放射性同位素等)进行标记，则在与标本中的相应Ab或Ag反应后，可以不必测定

Ag-Ab复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。

这种标记免疫技术般分为两类：

(1)免疫组化技术