可行性专项研究报告新

辽宁省科技攻关层次计划（JH2）项目可行性研究汇报腰椎间盘退变动物模型建立及生物技术诊疗贾长青中国医科大学隶属第二医院第一骨外科项目提出目标及意义本课题将依据现在椎间盘退变发生机制研究进展和进展趋势，以腰椎间盘退变模型为对象，探讨基因诊疗可行性。研究表明，在椎间盘退变早期在分子水平基因诊疗逐步显现出其优越性。伴随多种路径深入和完善，椎间盘疾病基因诊疗条件已趋于成熟。本课题设计利用TGF-β1基因修饰腰椎间盘退变模型骨髓间充质干细胞，经TGF-β1转染体外培养骨髓间充质干细胞后，将转染成功干细胞判定、筛选、扩增后移植入自体退变椎间盘中对其进行基因诊疗，相类似试验研究未见报道。该研究，可使现有基因诊疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面不足得到不一样程度改善；将是基因诊疗椎间盘退变一条新路径。为临床逆转椎间盘退变，预防腰椎间盘突出症发生提供理论基础和试验依据。椎间盘退变是椎间盘突出症及腰腿痛关键原因。流行病学调查发觉，80%人会经历一次或以上腰痛，其中5%人长久受到慢性腰痛困扰。椎间盘退变是困扰中国人民健康难题之一，它引发腰腿痛给病人和社会全部造成了沉重负担。现在，椎间盘退变疾病诊疗关键为保守诊疗和手术诊疗。保守诊疗为现在临床诊疗关键方法，但远期效果不佳。手术诊疗后，椎间盘生物学环境发生改变，相邻节段退变加速。近期效果佳，但远期效果需深入观察。多年来，伴随分子生物学、遗传学、免疫学、组织工程学发展及其在临床医学中应用，在椎间盘退变早期，针对其分子水平生物诊疗优越性越发显现。然而，从事这类研究关键步骤之一是椎间盘退变试验动物模型构建和制备，经过试验干预或自发过程，在试验动物体内模拟并观察分析椎间盘退变过程，从而为椎间盘退变病因学研究提供参考依据，进而可对椎间盘退变生物学诊疗进行正确评定。二、和项目相关中国外发展概况及市场需求分析为了椎间盘退变早期干预和修复，中国外学者做了大量探索。研究表明，细胞因子能够增加椎间盘局部细胞外基质合成，缺乏细胞因子或细胞因子合成水平降低会造成髓核内蛋白多糖降解增加、合成降低，蛋白多糖绝对量降低，继而引发椎间盘退变。Thompson〔1〕报道了细胞因子对成年狗椎间盘培养细胞影响，是最早探索用细胞因子诱导退变椎间盘修复研究之一。生长因子、巨噬细胞、肥大细胞在受损椎间盘纤维环修复及技法椎间盘退变中起关键作用〔2〕。WengerKH〔3〕等研究表明，在纤维软骨凋亡中，常压下细胞外基质基因正调整更关注于通常活动生物力学关键性，而高压下二种关键胶原分化调整显示了纤维环在病理力学环境下重塑能力。Sox9基因是Ⅱ型胶原合成过程中一个关键转录因子，其在软骨发育、成熟过程中对Ⅱ型胶原基因表示增强和促进Ⅱ型胶原合成增加作用已十分明确〔4〕。椎间盘软骨样细胞关键分泌基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMPs）如：MMp-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9〔6、7〕。它们是椎间盘基质关键降解酶，参与突出椎间盘自然吸收过程。白细胞介素-1（interleukin-1,IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2(PLE2)能促进其合成；转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）、胰岛素样生子因子-1（insulinlikegrowthfactor-1,IGF-1）、成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,FGF）等生长因子抑制其合成〔7-10〕。椎间盘及其环境、细胞和其产物复杂内部反应、髓核内部合成和分解代谢失衡全部直接造成椎间盘退变，从而为椎间盘基因诊疗提供两条不一样路径，即关键选择细胞因子和致炎因子拮抗剂作为基因诊疗目标基因。生长因子在离体间接试验中能使胶原及蛋白多糖合成增加〔11〕。Nishida〔12〕用腺病毒介导半乳糖苷酶（Lac-Z）基因进行了体内和体外试验，结果腺病毒载体能高效地将Lac-Z基因转导入髓核细胞，在随即研究中证实对应蛋白表示能够连续1年之久。以后很快，在体直接向椎间盘细胞导入诊疗基因TGF-β1取得成功〔13〕。Moon〔14〕把患者椎间盘细胞体外培养后利用Ad/CMV-Lac-Z载体直接转导，转导率100%。腺病毒介导TGF-β1在随即研究中也成功地转入体外培养人椎间盘细胞，其表示及蛋白多糖和胶原合成全部得到增加〔17〕。另有研究表明，组织基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMP-1)能够作为一个有效因子对椎间盘退变过程进行高效率调整和修复〔16〕。Sobajima〔17〕指出聚集蛋白聚糖和Ⅸ型基因愈加适合作为向椎间盘中转移候选基因，延缓或预防椎间盘退变发生。学者们在对基因诊疗椎间盘退变充足研究基础上，指出了椎间盘疾病未来研究方向。Masuda〔18〕将组织工程技术应用于椎间盘疾病诊疗，并已取得一定疗效。Ganey〔19〕提出向退变椎间盘中进行细胞移植，来改善椎间盘退变后细胞数目标降低；Okuma〔20〕也提出用同种异体细胞移植来诊疗椎间盘退变。Sakai〔21〕给兔椎间盘退变模型植入有生物学支架作用干细胞，2周后退变椎间盘得到一定程度修复。伴随多种路径深入和完善，椎间盘疾病基因诊疗条件已趋于成熟。TGF-β1是一个分子量为25kd双链多肽，生物活性极其广泛。它能促进未分化和分化早期软骨细胞增殖，刺激Ⅱ型胶原和蛋白多糖合成，而Ⅱ型胶原为髓核细胞关键胶原。TGF-β1基因是广泛用于多个组织修复关键基因；该基因序列清楚，便于取得，其基因产物对于腰椎间盘退变作用有大量可靠试验基础；这些全部为本试验进行提供了有益参考。有报道〔22，23〕利用TGF-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化取得成功。总而言之，椎间盘基因诊疗现在仍处于试验研究阶段，有些问题仍需深入探讨：（1）确定椎间盘退变相关基因，从基因水平上认识其发病生物学机制；（2）基因转入及表示有效性及其调控机制完善；（3）高效、安全表示载体选择；（4）基因导入方法改善；（5）基因诊疗中可能产生副作用。本项研究，在成功建立异常应力环境下椎间盘退变动物模型后，用TGF-β1转染体外培养骨髓间充质干细胞，然后将转染成功干细胞判定、筛选、扩增后移植入自体退变椎间盘中，用分子生物技术逆转腰椎间盘退变。本研究可使现有基因诊疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面不足得到不一样程度改善；本项研究成功后，有望进入临床前研究阶段，将在椎间盘退变诊疗方法上开辟一条新路径，其诊疗脊柱疾患临床应用前景更为宽广。参考文件：ThompsonJP,OegemaTRJr,BradfordDS.Stimulationofmaturecanineintervertebraldiscbygrowthfactors.Sping,1991，16（3）：253～260。PengB,HaoJ,HouS,WuW,JiangD,FuX,YangY；Possiblepathogenesisofpainfulintervertebraldiscdegeneration.Spine.，Mar1;31(5):560-6.WengerKH,WoodsJA,HolecekA,EcksteinEC,RobertsonJT,HastyKA；Matrixremodelingexpressioninanuluscellssubjectedtoincreasedcompressiveload；Spine.May15;30(10):1122-6.WrightE,HargraveMR,ChristiansenJ.TheSry-relatedgeneSox9isexpressedduringchondrogenesisinmouseembryos.NatureGenet,1995，9(1):15～20。龙厚情，陈晓亮，胡有谷.基质金属蛋白酶和腰椎间盘退变关系.中国矫形外科杂志，，7（4）：393～395。孙传海，吕刚.基质金属蛋白酶及其抑制剂和椎间盘退变、突出及吸收关系.中华骨科杂志，，10：630～632。NemotoO,YamagishiM,YamadaH.Matrixmetalloproteinase-3productionbyhumandegeneratedintervertebraldisc.JSpingDisord,1997，6:493～498。MatsuiY,MaedaM,NakagamiW.Theinvolvementofmatrixmetalloproteinasesandinflammationinlumbardischerniation.Sping,1998，8:863～868。GoupilleP,JaysonMI,ValatJP.Matrixmetalloproteinases:thecluetointervertebraldiscdegeneration.Spine,1998，14:1612～1626。DoitaM,KanataniT,OzakiT.Influenceofmacrophageinfiltrationofherniateddisctissueontheproductionofmatrixmetalloproteinasesleadingtodiscresorption.Spine,，15:26(14):1522～1527。龙厚清，李佛保，胡有谷.腰椎间盘中血管内皮生长因之表示及意义.中国脊柱脊髓杂志，，12（4）：280～282。NishidaK,KangJD,JK.Adenovirus-mediatedgenetransfertonucleuspulposuscells：implicationforthetreatmentofintervertebraldiscdegeneration.Spine,1998，23(22)2437～2443。NishidaK,KangJD,GilbertsonLG.Modulationofthebiologicactivityoftherabbitintervertebraldiscbygenetherapy:invivostudyofadenovirus-mediatedtransferofthehumantransformimggrowthfactorbeta-1encodinggene.Spine,1999，24(23):2419～2425。MoonSH,GilbertsonLG,NishidaK.Humanintervertebraldisccellsaregeneticallymodifiablebyadenovirus-mediatedgenetransfer:implicationsfortheclinicalmanageofintervertebraldiscdisorders.Spine,，25(20):2573～2579。WallachCJ,GilbertsonLG,KangJD.Genetherapyapplicationsforintervertebrldiscdegeneration.Spine,，28(15s):S93～S98。AdamLS,RobertC,LarsG.Genetherapyapproachesforintervertebraldiscdegeneration.Spine,，29(23):2770～2778。SobajimaS,KimJS,GilbertsonLG.Genetherapyfordegenerativediscdiscase.Spine,，11(4):390～401。MasudaK,SahRL,HejnaMJ.Anoveltwo-stepmethodfortheformationoftissue-engineeredcartilagebymaturebovinechondrocytes:alginate–recovered-chondrocyte(ARC)method.OrthopRes,，21(1):139～148。GaneyT,LiberaJ,MoosV.Discchondrocycytetranspralantationinacaninemodel:atreatmentfordegeneratedordamagedintervertebraldisc.Spine,，28(23):2609～2620。OkumaM,MochidaJ,NishimuraK.Reinsetionofstimulatednucleuspulposuscellsretardsintervertebraldiscdegeneration:anvitroandinvivoexperimentalstudy.JOrthopRes,，18(7):988～997。SakaiD,MochidaJ,YamamotoY.Transplantationofmesenchymalstemcellsembeddedinatelocollagengeltotheintervertebraldisc:apotentialtherapeutiecmodelfordiscdegeneration.Biomaterals,，24(20):3531～3541。郭常安，阎作勤，姚振均.脂质体介导转化生长因之-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化.复旦学报（医学版），，31（4）：343～346。霍建忠，陈峥嵘，蒋淳.转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞复合壳聚糖修复兔关节软骨缺损.中华风湿病学杂志，，9（7）：393～396。三、关键攻关内容及技术路线（技术可行性分析）一）、关键攻关内容依据椎间盘退变发生机制研究进展，以腰椎间盘退变模型为对象，探讨基因诊疗可行性。研究表明，在椎间盘退变早期，分子水平基因诊疗逐步显现出其优越性。伴随多种路径深入和完善，椎间盘疾病基因诊疗条件已趋于成熟。本课题设计利用TGF-β1基因修饰腰椎间盘退变模型骨髓间充质干细胞，经TGF-β1转染体外培养骨髓间充质干细胞后，将转染成功干细胞判定、筛选、扩增后移植入自体退变椎间盘中对其进行基因诊疗，相类似试验研究未见报道。该研究，可使现有基因诊疗中安全性、稳定性、免疫活性等方面不足得到不一样程度改善；为临床逆转椎间盘退变，预防腰椎间盘突出症发生提供理论基础和试验依据。二）、技术路线一、异常应力环境兔腰椎间盘退变模型建立及分组：兔腰椎间盘退变模型建立：速眠新0.3ml/kg肌注，麻醉后家兔取俯卧位固定于兔台上，备皮后消毒。以L5为中心取后正中切口长约12cm，在L4，5水平切断双侧竖棘肌。完整咬掉L4，L5，L6两侧关节突关节，止血后逐层缝合，和对照组相同条件下喂养6个月，MR证实L4.5,L5.6间隙发生退行性变(贾长青等。腰椎间盘退变模型建立及影像学观察。解剖学杂志。，27（3）：236-238)；兔腰椎间盘退变模型分组：试验组，对照组；骨髓间充质干细胞采集和培养：麻醉后自兔双股骨远端穿刺，用含有肝素-DMEM注射器抽取骨髓0.2ml，置于短试管中，反复冲洗，然后置于含有Percoll工作也试管中，使骨髓-DMEM液和分离液百分比为1:1；水平离心，抽取单个核细胞层细胞；用DMEM稀释，调整细胞浓度为1×106/ml；接种于培养瓶内培养；1-2周后进行判定；骨髓间充质干细胞判定：细胞形态学特征（光镜、电镜观察）；细胞组织化学特征（Ⅰ型胶原表示、糖原染色、脂肪染色、碱性磷酸酶染色）；组真核表示质粒pcDNA3-TGF-β1构建和判定EcoRⅠ酶切pcDNA（invitrogen企业）和TGF-β1基因(华美企业)，分别回收线性pcDNA载体和TGF-β1片段，前者以碱性磷酸酶处理后再和后者相连接构建重组质粒，以EcoRⅠ和KpnⅠ酶切判定和筛选转录方向正确重组体，命名为pcDNA3-TGF-β1。四、TGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞和判定⒈取骨髓间充质干细胞传代于6孔板中，37℃，5%CO2培养至细胞融合至90%～95%时进行转染。250ulOpti-MEM培养液中加入10ulLipofectamine混匀，另在250ulOpti-MEM培养液中加入4ug真核表示质粒（pcDNA3、pcDNA3-TGF-β1），混匀，将二者混匀室温放置20min，将Lipofectamine和真核表示质粒混合液缓慢加入6孔板中，边加边摇动，37℃，5%CO2培养6h后弃混合液，加入2ml完全培养液培养，24h后以1:10传代，36h后改用含有400ul/mlG418完全培养液培养，2W后G418浓度降至200ug／ml，筛选21d后克隆形成，将其挑至24孔板，生长至融合转移至6孔板，最终转至50ml培养瓶中。⒉转染后判定:经RT-PCR检测,证实TGF-β1目标基因已成功转染至骨髓间充质干细胞⒊TGF-β1基因表示检测：利用Westernblot方法检测转染后骨髓间充质干细胞,证实骨髓间充质干细胞连续表示TGF-β1蛋白质.五、观察转染骨髓基质干细胞移植入退变椎间盘后TGF-β1表示及椎间盘修复情况⒈分组:试验组:移植TGF-β1目标基因转染骨髓间充质干细胞对照组:移植未经TGF-β1目标基因转染骨髓间充质干细胞2．干细胞自体移植：动物麻醉后后正中切口L4.5为中心，将浓度104-106个/ml细胞液在X线监视下由椎间盘侧方注入髓核内3．疗效评定:移植细胞后1、3、6个月,组间对照,测量指标以下:⑴.基因诊疗稳定性观察:利用RT-PCR和Westernblot方法检测不一样时间TGF-β1mRNA及其产物表示情况.⑵退变椎间盘修复情况观察:①蛋白多糖含量检测.②椎间盘细胞增殖情况检测:MTT法测量细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞增殖周期.⑶退变间盘注入转染细胞后形态学观察：光镜、透射电镜观察.四、现有工作基础和条件工作基础：本项目责任人1997年起从事椎间盘退变和脊柱疾病应用基础和临床研究，期间负担省级课题2项，起建立异常应力下椎间盘退变动物模型，并对椎间盘退变、营养路径、细胞凋亡等方面进行了试验性研究，并已在关键杂志发表和本项目相关论文9篇（第一作者）。中国医科大学所含相关键试验平台有国家教育部关键试验室—呼吸疾病研究所，卫生部关键试验室——细胞生物学试验室（23618703），辽宁省转基因和基因敲除单位试验中心等，向全校开放，设备可随时预约使用。现在拥有仪器设备以下：超声多普勒仪（美国）DNA扩增仪（UNOI248BIOMETRAGER德国）核酸电泳仪（DYYI2E-6B北京）高速冷冻离心机（STRATOSKENDRO，美国）HPLC蛋白纯化装置（MAPS-100，美国）膜片钳装置（AXON1-D，美国）共聚焦激光扫描显微镜（TCS-SP2，LEICA，德国）蛋白电泳仪（MINI-PROTEINⅡ，BIO-RAD，美国）恒冷箱切片机（JUNGCM1800，LEICA，德国）振动切片机（LANCERVIBRATOMSERIES1000，美国）离心机（EPPENDROFCENTRIFUGE5417C，美国）生物反应发生器（Synthecon，美国）实时显微图像分析仪（LUZEX-F，日本）CO2细胞培养箱（NAOCO，MODEL5410）超净工作台（SW-CJ-IF，苏州）生物倒置显微镜（NiconTMS-FNo.301649，日本）透射电子显微镜（JEM-1200EX，日本）万能显微镜（OlympusBx60/PM30，日本）X射线能谱分析仪（JEM-1200EX，日本）超薄切片机（ultracut-E，Rechert-Jung，奥地利）流式细胞仪（FACSCAN美国）五、申请人基础条件课题责任人介绍贾长青，男，43岁，医学博士，副教授，硕士硕士导师，辽宁省、沈阳市医疗事故技术判定教授，本课题责任人。1988年7月中国医科大学本科毕业，1993年7月中国医科大学隶属二院获硕士学位，7月中国医科大学解剖和组织胚胎学专业博士毕业。科研工作：研究方向为椎间盘退变和脊柱疾病应用基础和临床研究。负担辽宁省自然科学基金1项（972239），辽宁省科技攻关项目1项（9925007）。现在指导硕士11名。完成论文20篇，其中关键文章12篇，BA引用2篇申请者发表和本项目相关关键论著目次和获奖情况：贾长青，王臣，陈勇。基质金属蛋白酶-3和血管内皮生长因子自不一样月龄大鼠椎间盘组织中表示和意义。，15（3）：355-360贾长青，王臣，陈勇等。MMP-3和IL-1在突出腰椎间盘组织中含量及其相关性研究。中国修复重建外科杂志，，12月（待发表）贾长青，柏树令，朱小兵。试验性脊柱内固定后对应区域椎间盘超微结构观察。中国修复重建外科杂志。，19（4）：295-298田伟、贾长青、柏树令。骨重组AECM和Wistar鼠成骨细胞体外联合培养试验研究。解剖学报，36（3）：314-317贾长青，柏树令，朱小兵。退变腰椎间盘内细胞凋亡检测和分析。中国临床解剖学杂志，，23（1）：90-92李小川、付勤、贾长青。一氧化氮合酶抑制剂对延缓腰椎间盘退变潜在意义。中华试验外科，，22（4）：81-83李小川、付勤、贾长青。一氧化氮合酶抑制剂对退行性变腰椎间盘基质代谢影响。中国临床康复，，9（6）：82-83（BA收录）贾长青，柏树令，朱小兵。腰椎间盘退变模型建立及影像学观察。解剖学杂志。，27（3）：236-238贾长青，柏树令，朱小兵。脊柱内固定后椎间盘营养路径试验研究。中国临床解剖杂志。，21（4）：359-361课题指导介绍柏树令，男，1945年11月30日生，满族，中共党员，教授、博士硕士导师。现任国务院学位委员会学科评议组组员、中国医科大学学位委员会副主席、中国医科大学基础医学院院长。工作单位：中国医科大学；家庭住址：沈阳市和平区南昌街18号862。联络电话：（O）、（H）社会兼职：中国解剖学会常务理事、教育工作委员会主任、人体解剖专业委员会副主任；中国修复重建外科专业委员会委员；《解剖学报》、《解剖学杂志》、《中国临床解剖学杂志》、《JournalofclinicalAnatomy》、《解剖学研究》、《中国微循环杂志》和《微循环学杂志》编委或常务编委；辽宁省解剖学会副理事长；中国医科大学解剖教研室副主任、中国医科大学组织工程学研究室主任。参与或主持国家自然基金、卫生部科学基金和省自然科学基金等多种科研基金共7项；获省政府科技进步一等奖2项；省部级科