内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用专家讲座

内源性调整性T细胞在SAH后脑血管痉挛及脑损伤中作用汇报人：张金卉导师：孙保亮内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第1页研究目标及意义SAH后脑血管痉挛、炎症反应及神经功效预后改进是一个非常复杂病理、生理、临床过程。即使进行了大量研究，为止其发生机制仍未完全明了。研究小鼠体内内源性调整性T细对SAH后脑血管痉挛、炎症反应及神经功效预后改进仍将是今后一个时期热点。伴随研究逐步深入，将会对内源性调整性T细胞移植SAH临床治疗及神经功效预后带来深远影响。内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第2页国内外相关文件内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第3页

TheKineticsofLymphocyteSubsetsand

MacrophagesinSubarachnoidSpaceAfter

SubarachnoidHemorrhageinRats

ithasbeensuggestedthathumoralimmunityplaysarolein

the

pathogenesisofcerebralvasospasmaftersubarachnoidhemorrhage,therehasbeennoquantitativeassay

forcellularimmunity.Westudiedthekineticsofimmunecellsinthesubarachnoidspaceafter

subarachnoidhemorrhageintherat.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第4页

Aserialresponseofimmunoreactivecells,whichresemblesthatofthechronicallergic

reactionobservedinautoimmunediseasesordelayed-typehypersensitivity,existsinthesubarachnoid

spaceaftersubarachnoidhemorrhage.Thepresentresultssuggestthattheinitialresponseincellular

immunity,whichisfollowedbyhumoralimmunityandeicosanoidreactions,playsaroleinelicitingthe

developmentofcerebralvasospasm.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第5页蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛

分子机制研究进展与NO代谢相关CVSK通道活性改变文氧合血红蛋白作用本磷酸二酯酶一V作用本NO和ET一1平衡失调内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第6页与NO代谢无关CVSRas蛋白作用前列环素与血栓烷A2失衡自由基与脂质过氧化物增多血管加压素作用ca代谢紊乱内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第7页Statin-InducedT-LymphocyteModulationandNeuroprotection

FollowingExperimentalSubarachnoidHemorrhage

Statinsinfluenceimmunesystem

activitiesthroughechanismsindependentoftheirlipidlowering

properties.Tcellscanbesubdividedbasedon

cytokinesecretionpatternsintotwosubsets:T-helpercells

type1(Th1)andtype2(Th2).Independentlaboratorystudies

haveshownstatinstobepotentinducersofaTh2switch

inimmunecellresponseandbeneuroprotectiveinseveralmodelsofcentralnervoussystem(CNS)disease.Thisstudy

wasthefirsttoevaluatetheimmunemodulatingeffectsof

statinsinsubarachnoidhemorrhage(SAH).内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第8页

Thepresentstudyelucidatedthepotential

roleofaTh2immuneswitchinstatinprovidedneuroprotection

followingSAH.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第9页Matrixmetalloproteinase-9concentrationin

thecerebralextracellularfluidofpatients

duringtheacutephaseofaneurysmal

subarachnoidhemorrhage

Elevatedcerebralinterstitialpro-MMP-9relatestoearlybraininjuryinaSAHpatients.Alargerprospectivestudyshouldbeperformedtoconfirmwhether

patientswithprolongedelevationorasecondpeakofcerebralpro-MMP-9wouldbemorelikelytodevelopDCIandtoconfirmwhetherMMP-9,amediatorof

neurovascularinjury,wouldbeworthtoconsiderasa

predictorofvasospasm.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第10页Trehalosetreatmentsuppressesinflammation,oxidativestress,andvasospasminducedby

experimentalsubarachnoidhemorrhage

Subarachnoidhemorrhage(SAH)frequentlyresultsinseveralcomplications,includingcerebral

vasospasm,associatedwithhighmortality.Althoughcerebralvasospasmisamajorcauseofbraindamagesafter

SAH,otherfactorssuchasinflammatoryresponsesandoxidativestressalsocontributetohighmortalityafterSAH.Trehaloseisanon-reducingdisaccharideinwhichtwoglucoseunitsarelinkedbyα,α-1,1-glycosidicbond,andhas

beenshowntoinducetolerancetoavarietyofstressorsinnumerousorganisms.Inthepresentstudy,we

investigatedtheeffectoftrehaloseoncerebralvasospasm,inflammatoryresponses,andoxidativestressinducedby

bloodinvitroandinvivo.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第11页

trehalosehassuppressiveeffectsonseveralpathologicalventsafterSAH,includingvasospasm,inflammatoryresponses,andlipidperoxidation.Trehalosemaybeanewtherapeuticapproach

fortreatmentofcomplicationsafterSAH.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第12页propertieswithinthecerebrospinalfluidafter

subarachnoidhemorrhageinvivoandinvitro

Tofunctionallycharacterizepro-inflammatoryandvasoconstrictivepropertiesofcerebrospinalfluid

afteraneurysmalsubarachnoidhemorrhage(SAH)invivoandinvitro.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第13页

Wefunctionallycharacterizedinflammatoryandvasoactivepropertiesofpatients’CSFafterSAHin

vivoandinvitro.Thispro-inflammatorymilieuinthesubarachnoidspacemightplayapivotalroleinthe

pathophysiologyofearlyanddelayedbraininjuryaswellasvasospasmdevelopmentfollowingSAH.内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第14页研究内容小鼠体内内源性调整性T细胞对蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛影响小鼠体内内源性调整性T细胞移植SAH后神经功效预后改进作用小鼠体内内源性调整性T细胞移植对SAH后炎症反应影响内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第15页每项研究内容均分4组1、Tregs删除组2、SAH模型组3、假手术组4、PBS腹腔注射组体重、窝别、喂养方法相同小鼠随机分组每组10~15只小鼠；每只小鼠编号后按计算机随机表分4组，双盲（研究者、负责资料搜集和分析人员也不了解分组情况）很好地防止了偏倚。内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第16页

研究方法

试验动物处理

1、Tregs删除腹腔注射0.25mgCD25特异性抗体小鼠加入肝素抗凝Hank's液洗涤、ELS裂解注射后第2天取外周血加入标识抗细胞表面特异性抗原抗体PBS洗两遍4℃下避光反应20-30分钟，洗涤2次加入标识抗细胞表面特异性抗原抗体FACSCalibur检测CD4+CD25+T细胞300μl染色缓冲液重悬细胞CD4+CD25+T细胞几乎降低至0%为调整性T细胞删除成功Cellquest搜集细胞并分析流式结果内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第17页2、SAH模型制作感觉有阻力时再继续前进3mm,总进入长度约为10mm(已刺破动脉壁）然后快速将线栓拔出，动脉血灌入，造成蛛网膜下腔出血将制备线栓经过切口经颈动脉插入颈内动脉，一直送至大脑前动脉与大脑中动脉分叉处（类似大脑中动脉阻断方法）首先制作线栓（5-0单丝尼龙线，头端磨成子弹头状，总长度15mm，直径0.2mm）3、假手术：碰到阻力即停顿继续插入，并快速退出线栓4、PBS腹腔注射：经腹腔注射与0.25mgCD25特异性抗体等体积PBS。内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第18页一、内源性调整性T细胞对蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛检测内容Text基底动脉形态学检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶mRNA和蛋白含量；NO含量；cGMP含量局部脑血流量循环内皮细胞检测基底动脉形态学检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶mRNA和蛋白含量；NO含量；cGMP含量局部脑血流量循环内皮细胞检测检测内容内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第19页局部脑血流量（regionalcerebralbloodflow,rCBF）检测：颅骨开窗，在立体定向仪控制下，在SAH前及SAH后12小时内（或6小时）用激光多普勒血流计动态测量动物顶叶皮层rCBF。内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第20页基底动脉形态学检测：1、立体显微镜下观察基底动脉（BA）、大脑中动脉（MCA）和大脑前动脉（ACA）并统计它们直径2、冰冻切片上显微镜下观察基底动脉形态学改变，用图像分析仪测定基底动脉内径、外径与管腔横截面积改用10％明胶和墨水混合液灌注13.5ml／min)15s于SAH后2天、2周，经心脏灌注，10％福尔马林灌注（5.5ml／min）２min后内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第21页循环内皮细胞检测：于SAH后3天、2周取静脉血标本，用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色检测循环内皮细胞（circulatingendothelialcell,CEC），以反应血管内皮细胞损伤。内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第22页于SAH后3天、2周，取动物脑底Willis动脉环及其相连动脉制备匀浆液

PCR、Westernblot等检测脑动脉匀浆液中一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase,NOS）mRNA和蛋白含量

硝酸酶还原法测定NO含量

放射免疫分析法测定cGMP含量内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第23页二、内源性调整性T细胞移植SAH后神经功效预后改进作用运动评分共12分感觉评分（5~15分）认知功效障碍评定SAH后神经功效预后评定内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第24页振动觉（1~3分）触觉（1~3分）视觉（1~3分）

对刺激触激反应（1~3分）嗅觉（1~3分）感觉评分内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第25页运动评分

平衡和协调能力（3分）

随意活

动（3分）

运动评分攀爬能力（3分）

肢体活动对称性（3分）

内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第26页认知功效障碍评定在2次测试中后一次测试中，将平台移去，让动物游泳30秒，计算动物抵达目标象限（原来放置平台位置）所花费时间和游泳速度。在术后3天和2周，对大鼠天天测试4次术后第2天在无平台情况下将大鼠放于Morris水迷宫进行驯化二次数据表示为动物找到沉水平台所需要时间（潜伏期）内源性调节性T细胞在SAH后脑血管痉挛和脑损伤中的作用第27页双击添加标题文字检测内容如树突状细胞、小胶质细胞及嗜中性粒细胞（Gr1抗体染中性粒细胞），染中心粒细胞时用GFAP（胶质细胞）、CD31（血管内皮细胞）MMP-9+血管长度（MMP-9与CD31双标识）检测Toll样受体TLR2和TLR4在基因和蛋白水平表示检测其下游信号分子如TRAK1、TRAF6、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等在蛋白水平表示中性粒细胞计数、淋巴细胞等计数血液标本检测相关免疫和炎性细胞因子如

TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β、

MCP-1等改变（其中IL-10和TGF-β为Tregs所分泌抗炎因子）

SAH后3天，用免疫组化染色来显示脑部炎性损伤主要细胞在SAH后3天，取大脑皮层和海马组织在SAH后3天