中药指纹图谱专家讲座

中药指纹图谱李文娟中药指纹图谱第1页中药指纹图谱介绍1中药指纹图谱研究方法2中药指纹图谱研究内容3中药指纹图谱建立与评价4中药指纹图谱示例5中药指纹图谱第2页1.中药指纹图谱介绍1.1指纹图谱起源与发展

中药指纹图谱判别借用了法医学指纹判定概念，指纹图谱技术应用于植物药质量控制历史沿革：20世纪70年代——色谱技术发展，人们大量采取薄层色谱（TLC）方法，将植物中化学成份展载于由各种担体铺成薄层板上。依据薄层板上斑点位置、斑点大小、斑点、颜色、斑点数目标多少进行定性判别，这种薄层判别方法具备了指纹图谱特征。20世纪70-80年代——出现薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图尝试应用于药材及成药分析。20世纪80-90年代——高效液相技术得到发展，同时植物药中化学成份分离判定、活性成份不停说明，高效液相广泛应用于定性、定量分析。西方普遍采取高效液相色谱法对植物药中已知及未知组分进行控制，并形成对应规范。当前高效液相色谱法已成为当前研究指纹图谱主要伎俩。中药指纹图谱第3页

中药化学信息：植物药（包含起源于植物中药材）提取物（包含中药汤药）与化学合成药最根本区分是，它（即使是单味药材）是各种化学成份混合体。这种各种化学成份综合体组成了“中药化学信息”。因为中药疗效由各种成份协同作用或“相克作用”，中药中化学信息有一定含糊性。只有部分化学信息（包含已知活性成份、已知非活性成份、一部分未知成份）可表征于指纹图谱中。1.2中药指纹图谱定义中药指纹图谱，即中药身份证，主要指中药化学指纹图谱，实际上是一个确保中药质量办法，是指对某种中药材或中成药等利用当代分离分析科学伎俩，得到能够标示该中药色谱或光谱图谱，最终用来对中药质量评价科学性方式。特点：经过指纹图谱特征性，能有效判别样品真伪或产地。经过指纹图谱主要特征峰面积或百分比制订，能有效控制产品质量，确保产品质量相对一致。中药指纹图谱第4页1.3指纹图谱在中药评价中应用指纹图谱在评价中药质量中作用主要能够概括为观察指纹图谱整体特征以判别生产前药材真伪;指纹图谱能够区分植物药材不一样部位;能够考查商品药材及成药质量;从标准指纹图谱可追踪制剂中一些化学成份改变;能够检测原料与成品之间,成品批间质量稳定性。由次生代谢产物组成中药提取物色谱指纹图谱不但具备个体绝正确惟一性，更强调是物种特征惟一性与同种植物中相同性。中药指纹图谱第5页1.4中药指纹图谱分类中药指纹图谱按应用对象分类，依据中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程各个阶段，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包含饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细，还可包含用于工艺生产过程中间产物指纹图谱。两种中药原料药指纹图谱应区分对待。对中药饮片指纹图谱要求基本和中药材指纹图谱相同。对中药配伍颗粒(包含标准提取物)指纹图谱应要求高一点。中药指纹图谱按测定伎俩可分为中药化学(成份)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药化学(成份)指纹图谱系指采取光谱、色谱和其它分析方法建立用以表征中药化学成份特征指纹图谱。光谱最惯用是红外光谱(IR)。色谱最惯用是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。其它方法包含波谱和联用技术。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。TLC法简便易行，但提供信息量有限，极难反应几十种、上百种化学成份组成复杂体系。GC适合用于挥发性化学成份。HPLC适合用于非挥发性成份，中药中大部分化学成份均可用HPLC法得出良好指纹图谱。CE适合用于大部分化学成份，尤其是生物大分子——肽和蛋白分离，但其重现性有待提升。中药指纹图谱第6页1.5中药指纹图谱建立意义与标准

中药指纹图谱建立是全方面反应中药内在化学成份种类与数量，进而反应中药质量。现阶段中药有效成份绝大多数没有明确，采取中药指纹图谱方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱已为国际社会所认可，有利于中药及产品进入国际市场。中药指纹图谱建立，应以系统化学成份和药理学研究为依靠，应表达系统性、特征性、重现性三个基本标准。实现中药指纹图谱三标准，确保其标准化，做到统一规范，这么才能够使中药指纹图谱得以推广应用。中药指纹图谱第7页

“系统性”是指指纹图谱所反应化学成份应包含中药有效部位所含大部分成妥种类，或指标成份全部。“特征性”是指指纹图谱中反应化学成份信息（详细表现为保留时间或位移值）是含有高度选择性，这些信息综合结果，将能特征地域分中药真伪与优劣，成为中药本身“化学条码”。“重现性”是指所建立指纹图谱，在要求方法与条件下，不一样操作者和不一样试验室应能作出相同指纹图谱，其误差应在允许范例内，这么才能够确保指纹图谱使用含有通用性和实用性，也是作为标准方法所必备特征之一。实现指纹图谱重现性，除在样品制备方法、分析过程、结果处理待步骤规范操作外，还应建立对应评价机制，对指纹图谱进行客观评价，并公布标准指纹图谱。中药指纹图谱第8页2.中药指纹图谱研究方法学2.1惯用指纹图谱研究方法与技术利用包含光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术联用等当代分析技术，将中药化学信息经过色谱图（液相色谱图、气相色谱图或薄层色谱图）等方式进行表示；而且对指纹图谱经过计算、分析、比较、评价等过程，以技术参数、指纹特征等加以说明。研究对象不一样，指纹图谱研究方法与技术也不一样，并都伴随当代科技技术发展而发展，中药指纹图谱研究所采取方法大致分为：色谱法：薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（CE）；光谱法：紫外光谱法（UV）、红外光谱法（IR）、近红外光谱法（NIR）；核磁共振法（NMR）等。色谱联用技术：将色谱良好分离能力与光谱或波谱特有结构判别能力相结合并借助近年来发展起来化学计量学技术和己有光谱波谱标准库，是完全可能对大部分中药化学成份进行定性和相对定量分析。当前色谱光谱联用技术如:GC-MS、HPLC-MS已经在中药指纹指纹图谱研究领域内取得了一定成功。中药指纹图谱第9页薄层色谱(TLC)特点：因为操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，能够提供色彩斑澜彩色图像，直观易辨，在中药判别中应用频率最高。采取合格材料和标准操作，可得到高质量色谱图像，于同板同时比较判别多个样品，配合数码成像和数据处理，还可瞬间形成轮廓图谱，并给出各峰积分值，加大信息量，从而提升综合分析能力，比较适合原料药材指纹图像分析。应用：TLC作为主要判别方法被多国植物药典收载。《中国药典))年版一部采取薄层色谱法作判别品种已达602种，占所收载中药材60％以上。近年来TLC指纹图谱研究也较多，谢培山等对人参、西洋参、三七，在优化规范操作条件下得到薄层色谱荧光彩色图像，在同一板上形象地比较了3个样品异同。颜玉贞等对黄连TLC指纹图谱研究发，其荧光及紫外扫描轮廓图可用以判别黄连。李彩君等对高良姜中黄酮类成份进行了薄层色谱指纹图谱研究，可有效地判别高良姜。薄层色谱可同时判别多个样品。缺点：存在着效能低、灵敏度差缺点。而且其层析系统是一开放体系。要想得到稳定、重现性好图谱，必须严格控制试验条件。其提供信息有限对于成份复杂中药及其复方制剂难以用TLC指纹图谱来判别及评价质量。中药指纹图谱第10页气相色谱(GC)特点：以气体为流动相，对于含挥发性成份中药判别含有一定优势。因为裂解气相色谱含有操作简便、样品无须化学前处理、提供信息量大等优点而格外引人注目。该方法将样品故人裂解器内，在一定条件下将样品加热使其瞬间裂解，生成可挥发性小分子物质，马上被载气带人气相色谱系统分析柱上，分离后得到含有指纹性质裂解气相色谱图。假如将气相色谱与质谱、傅立叶变换红外光谱联用，则不但能够知道不一样中药中挥发性成份差异，而且能够对这些成份进行判定。应用：气相色谱适合用于药品中挥发性成份分析，实际应用中常与质谱联用。凌大奎等用规范化色谱分离油成份GC保留指数(GCRI)，利用GC-MS和GC-傅利叶变换红外光谱(FTIR)对各主要成份进行了定性判别。钱浩泉等用GC-MS联用方法，对高良姜及其近缘植物进行判别，发觉它们指纹特征显著不一样，各自特有色谱图谱含有特征代表性。中药指纹图谱第11页高效液相色谱(HPLC)特点：含有分离效能高、分析速度快、灵敏度高、方法重现性好、选择性高、适用样品类型广泛等特点。与薄层色谱相比，它是封闭系统色谱，受外界影响小，色谱稳定性、重现性好，其分离、判别能力远远高于薄层色谱。HPLC所分析中药中，有相当部分为次生代谢产物，而这些产物组成和含量不但和药材本身种属相关，同时还与植物后天所处地域环境、生长条件、采摘时间和炮制方法有很大关系。对于中成药来说，与产品加工过程也有很大联络。不一样加工过程与方法都将对所得指纹图谱有相当影响，表现在峰高、峰面积、保留时间以及峰数量上改变等。所以，HPLC不但能够用来对生药真伪、优劣进行判定，同时还能够对中药加工过程进行监测，能够有效地分析判定经过不一样炮制、加工中成药。应用：已经普遍应用于中药材及制剂分析检测，尤其是三维高效液相色谱法近年来发展很快，非常适合构建中药指纹图谱。在中药指纹图谱中首推高效液相色谱指纹图谱。粟晓黎等利用HPLC指纹图谱法对中药鬼臼毒性成份进行分析，指出利用鬼臼HPLC指纹图谱能够判别鬼臼(桃儿七)、龙胆、威灵仙。高增平等以人参皂苷，为对照，建立了三七药材HPLC指纹图谱。翟为民等建立了人参、西洋参及三七HPLC指纹图谱用以判别区分三者。中药指纹图谱第12页高速逆流色谱指纹图谱(HSCCC)特点：HSCCC利用动态液-液分配原理分离样品，其分离度和重现性与HPLC类似，但样品前处理简单。详细地说它是一个基于液-液多级逆流萃取建立色谱体系，以轻巧聚四氟乙烯螺旋管作分离柱，在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、分离过程；无固相载体，防止了待分离样品与固相载体表面发生化学反应而变成不可逆吸附；分辨率高，可分离纯品；可采取正向或反向连续洗脱、步级洗脱、梯度洗脱等方式；可采取各种多样溶剂系统实现物质对流分配；能在一个流程中分离复杂样品中极性差异极大各个组分，尤其是能有效地分离强极性组分；仪器及试剂成本显著低于高效液相色谱，应用：适合用于制备高纯度、高附加值化合物。沈平孃研究了HSCCC在中草药分离、分析方面应用。中药指纹图谱第13页超临界流体色谱法(SFC)特点：以超临界流体作流动相，它经过控制压力调整流动相密度实现对溶解度调整，从而使不一样物质分别进行溶解与分离。超临界流体溶解能力强，流动性好，传质速率快，融合了HPLC和GC优点而部分地防止了它们缺点。SFC比GC应用范围更广，比HPLC定量效果更加好，分离时间更短，样品前处理更简单，更易与大型分析仪如质谱仪、傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振谱仪等联用。应用：SFC适用范围很广，理论上，能够用HPLC分离和测定化合物，都能够用SFC来分离和测定，一些用HPLC不能分离物质用SFC也能得到很好效果。中药指纹图谱第14页高效毛细管电泳技术(HPCE)特点：是近10多年来发展很快一个高效分离分析技术，以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上差异而实现分离。含有灵敏度高、柱效高、分析速度快、所需样品量少、溶剂消耗少和抗污染能力强等优点。应用：不但适合用于小分子酸碱、盐及中性分子和生物大分子如核酸、多肽、蛋白质等分析，在中药有效成份分析方面也显示出一定优势。中国药典年版已将其定为法定定性定量方法。孙毓庆等以毛细管电泳指纹图谱研究了冬虫夏草与蛹虫草、人工蛹虫革、伪品及次品区分。中药指纹图谱第15页紫外光谱(UV)和红外光谱(IR)

UV——特征差异，在—定程度上反应了中药化学成份差异。一些情况下，伪品虽可在外观上以假乱真，但其化学成份组成和含量与正品必有差异，这种差异在紫外光谱上必有所反应。假如中药亲缘相近而紫外光谱不易区分，可采取多阶导数光谱法提升分辨率。IR——一直是药品判定权威方法，但这是对纯物质而言。中药提取液是复杂混合物体系，这一混合物红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不一样，它是混合物中各组分红外光谱叠加。中药各种化学成份只要质和量相对稳定，而且样品处理方法按统一要求进行，则其红外光谱应是相对稳定。这么得到混合物红外光谱应该含有一定客观性和可重复性。据此原理，无须将混合物红外光谱各主要吸收峰进行归属，只要在4000-400cm-1范围内比较光谱差异即可。应该指出，紫外和红外光谱都含有加和性，对于混合物来说，其判别专属性差，分辨率低。需借助计算机模式识别技术或含糊数学方法进行处理。中药指纹图谱第16页核磁共振波谱(NMR)特点：植物中药特征性化学成份往往不限一个，多表现为特征性成份组。所以，其特征性标准提取物NMR谱是其中各种成份图谱叠加。在混合物NMR图谱上，除每个信号在磁场中共振数据外，信号相对强弱反应了混合物中各组分相对含量。当图谱不太复杂时，也可观察到一些信号偶合关系。经过对各化合物进行结构判定和NMR研究，可实现植物中药NMR指纹图谱解析。应用：它是判定有机化合物结构常规方法和主要伎俩。依据核磁共振谱图上吸收峰位置和强度，可取得化合物各类质子化学位移、数量、偶合关系等结构信息。1HNMR图谱含有良好重现性和特征性，适合用于中药品种判别和中药特征总提取物判定。秦海林等对人参、天麻、黄连、虎杖、何首乌等特征总提取物1HNMR指纹图谱进行了研究，结果表明，所研究各种植物1HNMR指纹图谱含有高度特征性和很好重现性，同一品种不一样产地样品1HNMR指纹图谱也有很好一致性。中药指纹图谱第17页多维多息特征谱即联用技术特点：将色谱法良好分离能力与波谱法特有结构判别能力相结合。所谓多维是指采取各种分析仪器联用模式，所谓多息是指中药特征谱应包含化学和药效两方面信息。单一分析方法难以反应中药复杂性，近年来采取各种当代分析仪器联用方式得到多维多息特征谱应用在增加，已成为非常有效分离、判定伎俩。比如：GC/MS、LC/MS、HPLC/MS、HPLC/NMR、CE/MS等联用技术为中药指纹图谱研究应用提供大量信息。应用：当前最惯用是高效液相色谱(或毛细管电泳)／二极管阵列检测器／质谱／质谱联用方式(HPLC或CE/DAD/MS/MS)得到指纹图谱。如利用液质技术对样品进行指纹图谱确实定，应用质谱中质荷比(M/Z)值及HPLC图峰响应比值比较二者差异；利用LC-MS联用技术对样品组分进行多维多息化学特征谱指认，经过质谱中质荷比(M/Z)值及HPLC中峰保留时间相互对照，主要成份进行归属。中药指纹图谱第18页3.中药指纹图谱研究内容针对中药材(炮制品、饮片)以及各类中药复方制剂，研究不一样样品制备方法及有效组分分离方法。利用包含色谱、光谱以及多维、联用分析技术，全方面开展指纹图谱测试，建立含有普适意义、规范化中药指纹图谱。主要包含以下内容:

1)中药有效组分提取及分离方法研究及其规范化。2)色谱分离分析条件优化技术研究。3)多维、联用分析新技术方法学研究。4)指纹图谱中活性成份分析与判定。5)中药指纹图谱分析方法规范化研究。

中药指纹图谱第19页3.1指纹图谱判别方法指纹图谱判别方法研究主要包含:中药指纹图谱化学特征信息提取方法研究。同一分析方法不一样检测方式及不一样分析方法取得多源检测数据间相关性。指纹图谱相同度计算方法。中药指纹图谱快速处理方法。建立中药指纹图谱判别计算方法体系。中药指纹图谱质量控制主要包含:1)中药指纹图谱在中药材真伪判别及质量评价中应用。2)中药指纹图谱在中药制剂生产工艺全过程质量控制和最终产品质量评价，提出采取中药指纹图谱来实现从药材、半成品到最终产品全过程质量控制方法。3)中药指纹图谱在中药新药创制中应用研究。中药指纹图谱第20页3.3研究指纹图谱普通流程中药指纹图谱第21页步骤1：供试品搜集，获取中药或中药材(供试品)并编号，标明产地、起源等等(搜集不少于10批)。步骤2：判定，即委托相关部门对其进行判定(如:基源判定、性状判定、显微判定、理化判定，得到判定结果(如：真伪，优劣等)。步骤3：经过试验伎俩获取各中药或中药材色谱指纹图谱。步骤4：色谱峰指认，即人为标定出该中药或中药材一组共有指纹峰，并在试验所得每张色谱指纹图谱中将它们找出来。步骤5：以共有指纹峰为指标进行聚类分析，得到聚类分析结果，并与判定结果进行比较，比较结果应该相互符合，假如不符合就要从步骤1-5中找出不符合原并因加以修正。步骤6

：从判定和聚类分析都认为品质比很好中药或中药材中选取一部分(普通为十个或十个以上)，以他们色谱图为依据建立对照色谱指纹图谱。步骤7

：以对照色谱指纹图谱为标准图谱，检验全部供试品，并与判定结果进行比较，比较结果应该相互符合，假如不符合就要从步骤1-7中找出不符合原因并加以修正。步骤8

：将对照色谱指纹图谱发放到厂家或相关部门试用。步骤9

：国家相关部门对色谱指纹图谱校验和复核。步骤10

：指纹图谱质量标准书写。3.4现行中药色谱指纹图谱研究工作普通流程：中药指纹图谱第22页3.5研究指纹图谱关键技术研究对象确实定

植物药或中药成份可分为：蛋白质、脂类、糖及衍生物、有机酸、酚类、鞣质、醌类、内酯、香豆精、黄酮类皂苷类、生物碱类、甾体类、萜类、挥发油等。当研究某个注射剂品种指纹图谱时，首先必须调研相关文件、新药申报资料（质量部分和工艺部分）及其它研究结果，尽可能详尽地了解药材、中间体及成品中所含水量成份种类及其理化性质，经综合分析后找出成品中药效成妥或有效成份，作为成品或中间体指纹图谱研究对象，即分析检测目标。研究方法选择

主要采取色谱法。各种色谱法是互补，应依据研究对象实际需要和可能以及按照不一样色谱特点和优势而定，目标是确保方法重现性和确能反应产品质量主要化学成份。一个中药制剂指纹图谱应能够同时采取两种或更各种方法进行研究。指纹图谱研究方法应依据研究对象物理化学性质来选择，大多数方法可采取HPLC法。通常挥发油类采取GC。一些难以检测或采取上述方法得不到较理想分离效果时，可采取TLC或CE。研究内容依据国家药品监督管理局下发《中药注射剂指纹图谱研究技术要求》（暂行）要求，主要研究内容有原药材、中间体、注射剂指纹图谱，包括样品名称、起源、制备、测定方法、指纹图谱及技术参数等研究项。中药指纹图谱第23页4.中药色谱指纹图谱建立与评价

按技术要求分析/抽检成品，并与对照色谱指纹图谱及技术参数比较，判别检测产品是否合格，是实施中药指纹图谱最终目标。实现中药指纹国库券谱技术革新，除了研究中药色谱指纹图谱，还包含对照指纹图谱及其技术参数建立与指纹图谱评价等过程。中药指纹图谱第24页4.1对照指纹图谱建立与指纹图谱评价

当前对中药材、中间体及成品（主要为注射剂）指纹图谱研究大多采取图谱法，经分析检测得到了大量色谱数据。按《中药注射剂指纹图谱研究技术要求》（暂行），需对以上色谱数据进行处理，才能得到指纹图谱技术参数。如：相对保留时间、峰面积比值、相对标准偏差等。当前多采取人工手动计算方法或借助于MicrosoftExcell等应用软件计算这些参数，繁琐，易出差错，计算操作过程了也不规范。现在已对计算公式及计算过程要求规范。中药指纹图谱第25页相关技术参数计算公式（1）相对保留时间RTRTR（i）

TR（S）TR（i）各色谱峰保留时间TR（s）参考峰保留时间（2）积分相对比值RAA（i）

RA=A（s）A（i）为各色谱峰积分面积；

A（s）为参考峰积分面积。中药指纹图谱第26页（3）相对标准偏差RSD%

∑（Xi

–X）2

n-1RSD%=

XXi为样品对应参数；X为均值；n为样品数量（个）。中药指纹图谱第27页4.2中药色谱对照指纹图谱建立与中药色谱指纹图谱评价标准中药指纹图谱及技术参数一旦建立，就能够作为“标准”或“对照”/“参考”，所起作用如同对照药材，样品色谱图谱可与对照指纹图谱进行比较。在对照指纹图谱建立及与中药指纹图谱评价过程中须综合考虑以下标准。中药指纹图谱第28页整体性对照指纹图谱建与评价应注意指纹特征整体性。一个品种对照指纹图谱是由各个含有指纹意义峰组成完整图谱组成，各个有指纹意义峰（或薄层色谱斑点）其位置（保留时间或比移值）、大小或高你（积分面积或峰高）、各峰之间相正确百分比是指纹图谱综合参数，建立和评价时从整体角度综合考虑，注意各有指纹意义峰相互依存关系。中药色谱指纹图谱在一定程度上与临床疗效稳定性及用药安全性方面有相关性，所以对照指纹图谱中全部色谱峰在样品指纹图谱中均应表达且可追溯。只有在对照指纹图谱中全部色谱峰稳定表达，才是确保产品真正稳定可控前提。为确保色谱指纹图谱在整体上相同，在建立对照指纹图谱时：①应尽可能包含全部含有指纹意义特征峰，尤其是含量少面指纹意义显著色谱峰、指纹特征区、共有特征区；②排除溶剂峰及其它能够追溯杂质峰，供试品制备应与工业生产相同，并尽可能采取流动相来溶解。经过比较指纹图谱在整体上相同，楞以判断出样品真实性.中药指纹图谱第29页含糊性

在实际过程中因为受到各种原因影响，样品指纹图谱中有可能出现个别色谱峰增加/降低，色谱峰图谱行为可能发生改变，如峰形、峰宽、峰高发生改变及保留时间发生偏移等，不可机械性地经过色谱图叠加来评价反指纹色谱图和相同。增加/降低色谱峰对指纹图谱整体相同贡献，不是单纯性降低，有可能出现相互消长现象。对于难以把握色谱峰，提议由软件去进行判别评价，尽可能防止人为判别评价。中药指纹图谱第30页4.3指纹图谱评价方法指纹图谱相同性评价从两个方面考虑：（1）色谱整体“面貌”，即有指纹意义峰数目、峰位置和次序、各峰之间大致百分比（薄层色谱还有斑点颜色）等是否相同，以判断样品真实性。（2）以样品与对照样品或“标准图谱”