临床基因诊断进展专家讲座

临床分子生物学诊疗进展陈鸣教授主任医师第三军医大学第三从属医院检验chenming1971@临床基因诊断进展第1页OUTLINE测序技术乙肝病毒耐药突变检测预测一些疾病遗传风险程度肿瘤化疗药品敏感试验生物芯片技术固相芯片液相芯片临床基因诊断进展第2页基因组和分子检测：生物芯片技术DNA芯片

cDNA芯片Oligo芯片

信息生物芯片

多肽芯片

生物芯片

微流体芯片功效生物芯片芯片试验室

组织芯片

蛋白芯片

抗体芯片

蛋白质芯片SAGE/CAGEepigenetics芯片质粒microarray微株array基因组genetics转录组mRNA临床基因诊断进展第3页Introduction“Science”:Foder提出基因芯片概念1991第一张基因芯片：美国Affymetrix企业1992第一张以玻璃为载体基因芯片：Stanford大学P．Brown试验室，1995“Science”:Schena基因表示谱研究，1995第一张实用型基因芯片：Affymetrix1996中国科学界第一次专题讨论：第80次“香山科学会议”上，1997年9月1998年度自然科学领域十大进展之一美国正式开启基因芯片计划：1998“生物芯片技术”正式列入国家“863”计划：1999临床基因诊断进展第4页SampleDNAEachspotcontainsknownDNABiochipComplementaryDNAhybridizeSignalappearsBiochipBasedonHybridization临床基因诊断进展第5页临床基因诊断进展第6页7我国残疾人口有8296万，其中耳聋残疾人群占万，占24%，累及2.6亿家庭人口。耳聋人群年第二次全国残疾人抽样调查数据临床基因诊断进展第7页8耳聋非综合征型耳聋（70%）遗传原因(约60%)常染色体隐性（80%）环境原因（约40%）综合征型耳聋（30%）Alport综合征Pendred综合征Waardenburg综合征BOR综合征Usher综合征细菌感染病毒感染耳毒性药品声损伤……常染色体显性（15%）X—连锁（1%~3%）线粒体﹙＜1%﹚耳聋致病因素临床基因诊断进展第8页9中国人群遗传性耳聋特点遗传性耳聋突变位点含有显著种族差异中国人群大部分遗传性耳聋由4个基因突变所引发：GJB2、GJB3、SLC26A4（PDS）、mtDNA12srRNA等中国人群耳聋突变热点：GJB2：35delG，176del16，235delG，299delATSLC26A4（PDS）：IVS7-2A>G，2168A>GGJB3：538C>T线粒体：12SrRNA：1555A>G，1494C>T临床基因诊断进展第9页10基因型与临床表型对应关系线粒体基因C1494T、A1555G突变：——氨基糖甙类药品敏感性耳聋GJB2基因：——先天性重度以上感音神经性耳聋PDS基因：——大前庭导水管综合征（EVAS）一个内耳畸形，先天或后天重度以上感音神经性耳聋GJB3：——后天高频感音神经性耳聋临床基因诊断进展第10页11遗传性耳聋遗传特点父母均为健康携带者临床基因诊断进展第11页12耳聋基因检测价值耳聋父亲耳聋母亲儿女100%发病尽可能防止两个同一基因纯合突变聋人结婚！针对聋人群体：临床基因诊断进展第12页13耳聋基因检测价值耳聋父亲耳聋母亲儿女正常携带者100%基因检测可指导聋人婚配，防止婚后再生聋儿！针对聋人群体：临床基因诊断进展第13页14基因在NSHL中所占百分比突变热点主要人群百分比GJB2~40%35delGCaucasoid50-70%176del16Asiannodata235delGChinese>80%299delATAsiannodataGJB3nodata538C>TChinesenodataPDS~40%IVS7-2A>GChinese>50%2168A>GChinese>10%Japanese>50%12SrRNAnodata1555A>GChinese>7%1494C>TChinesenodata现有位点可覆盖中国人群中98%GJB2,80%PDS,90%药品性耳聋患者遗传性耳聋检测试剂盒包含基因位点临床基因诊断进展第14页晶芯®遗传性耳聋基因检测试剂盒标本采集3管EDTA抗凝紫头管（最好空腹）临床基因诊断进展第15页16遗传性耳聋检测芯片检测结果235杂合1555均质IVS杂合2168和IVS复合杂合2168纯合WildTypeControlWildtypeMutation可对四个基因9个位点基因型进行准确检测，汇报野生、杂合突变或纯合突变等三种结果QCBCPCPCNCQC35WIC35538W35MICG3538M176W1494W

PC176M1494MBC235W1555W2168W235M1555M2168M299WICmtIVSW299MIC21IVSMICG2BCICIVS临床基因诊断进展第16页检测意义GJB2基因——

先天性耳聋基因：当GJB2基因发生突变时，患者出生即表现出耳聋症状

检测意义：为耳聋患者确诊病因；指导生育有聋儿家庭再次生育；筛查有耳聋家族史家庭组员基因突变情况；等临床基因诊断进展第17页线粒体12srRNA基因——药毒性耳聋致病基因：当该基因发生突变时，患者听力正常，但当使用氨基糖甙类药品时，就会造成重度耳聋发生检测意义：经过检测此基因，能够明确被检者该基因突变情况，指导患者用药；明确患者家庭中该疾病遗传性临床基因诊断进展第18页19临床基因诊断进展第19页GJB3基因——

后天性耳聋基因：当GJB3基因发生突变时，患者青少年时期听力正常，当发育至青壮年期间（20～30岁）时，听力逐步下降，直至发生重度耳聋

检测意义：经过检测此基因，能够为听力下降患者明确病因；指导生育有聋病患者家庭再次生育；筛查有耳聋家族史家庭组员基因突变情况临床基因诊断进展第20页SLC26A4（PDS）基因——

大前庭导水管综合征致病基因：当PDS基因发生突变时，患者出生时耳蜗发生畸变，但不发生耳聋症状，当患者患感冒、头部受打击时，听力逐步下降，直至发生重度耳聋检测意义：经过检测此基因，能够为听力下降患者明确病因；指导患者生活习惯，指导生育有聋病患者家庭再次生育；筛查有耳聋家族史家庭组员基因突变情况临床基因诊断进展第21页实例介绍122样本由杭州惠耳听力提供父亲：2168突变携带者；听力正常母亲：IVS突变携带者；听力正常孩子：SLC26A4基因复合杂合；聋儿临床基因诊断进展第22页实例介绍223样本由中国聋康中心提供父亲：235突变携带者；听力正常母亲：299突变携带者；听力正常孩子：GJB2基因复合杂合；聋儿临床基因诊断进展第23页实例介绍324父亲：野生型；聋儿母亲：野生型；聋儿孩子：野生型；听力正常样本由大坪医院提供临床基因诊断进展第24页Luminex200TM多功效流式点阵仪液态芯片是基于Luminex200TM（美国Luminex企业）是一个多功效生物芯片平台，既能检测蛋白、又能检测核酸高通量技术平台通惯用于免疫分析、核酸分析、受体和配体分析等临床检测和科学研究LuminexTM有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新高速数字信号和计算机运使用方法则，含有很高检测特异性和灵敏度Luminex200TM临床基因诊断进展第25页LuminexxMAP®Technology-1临床基因诊断进展第26页LuminexxMAP®Technology-2临床基因诊断进展第27页LuminexxMAP®Technology-2临床基因诊断进展第28页4263318525816临床基因诊断进展第29页HPVDNA分型检测液芯操作配套设备

多重PCR

杂交30-40min2.5hr15min40sec/sample

xMAPTM检测

抽提DNA

标本采集采样刷、细胞保留液、冰箱离心机（10000rpm）、TIP头（大、中、小）、EP管、水浴锅、金属加热器、移液器（1000µl、200µl）、手套、口罩PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管、PCR试验室流式荧光仪（Luminex200TM）、电脑PCR仪（非荧光）、TIP头（大、中、小）、PCR管临床基因诊断进展第30页液芯HPVDNA分型产品三大优势激光分析，数字结果无需洗涤，降低污染液相杂交，重复性好临床基因诊断进展第31页液相杂交，效率高、重复性好固态芯片产品：膜条式反向杂交，基质不均一，温控困难，重复性差液芯产品：液相杂交，反应彻底，温控严格，重复性好临床基因诊断进展第32页Solid-PhaseKinetics临床基因诊断进展第33页Solution-PhaseKinetics临床基因诊断进展第34页临床基因诊断进展第35页临床基因诊断进展第36页临床基因诊断进展第37页已获SFDA药证项目HPV分型（高危、低危型，同时检测26种压型）肿瘤标志物（13种）本身免疫性疾病诊疗标识物临床基因诊断进展第38页OUTLINE测序技术乙肝病毒耐药突变检测预测一些疾病遗传风险程度肿瘤化疗药品敏感试验生物芯片技术固相芯片液相芯片临床基因诊断进展第39页人类基因组计划

TheHumanGenomeProject1985:提出对整个人类基因组DNA测序1990:国际合作项目，历时13年花费：$3Billion临床基因诊断进展第40页人类基因组计划

TheHumanGenomeProject临床基因诊断进展第41页人类基因组计划

TheHumanGenomeProject临床基因诊断进展第42页4.dNTP’s(dATP,dGTP,dCTP,anddTTP)ddGTPddCTPddTTPddATP5.荧光标识ddNTP’s：不一样荧光标识Nowwerunourproductsongel6.DNAPolymerase3.互补引物5’5’5’5’一个反应1.一个反应中，

一个未知片断5’5’5’5’2.有一段已知序列3’3’3’3’7.ddNTP参入----链合成终止3’3’3’3’双脱氧荧光测序方法临床基因诊断进展第43页荧光ddGTPddATPddTTPddCTP同位素Sequenceofunknownfragment3'CGCGCGCGCGTATATATATATAT5'AATATATATGCGCGCGCvs.电泳和数据产生:Sequenceofunknownfragment3'CGShortestsynthesizedband=5’endofsynthesizedstrand5'TALongestsynthesizedband=3’endofsynthesizedstrand临床基因诊断进展第44页全自动测序方法AutomatedSequencing临床基因诊断进展第45页测序技术飞跃年，“HGP”取得首张人类全基因组图谱，花费了30亿美元和13年时间CraigVenter开发出一个快速追踪测序方法，并于年9月完成Venter本身全基因组测定工作，花费了大约1亿美元BadboyofScience临床基因诊断进展第46页测序技术飞跃.4.17《Nature》杂志上，454测序新技术：美国454LifeSciences企业，花了150万美元，4个月IlluminagenomeanalyzerAppliedBiosystemsSOLiDsequencer临床基因诊断进展第47页454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)MixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)Create“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementLoadbeadsintoPicoTiter™Plate

LoadEnzymeBeads44μm

临床基因诊断进展第48页临床基因诊断进展第49页7/12/202450临床基因诊断进展第50页测序技术飞跃Helicos企业开发HeliScopeSequencer“单分子测序”不需要PCR扩增成本最低目标：10万美元，3个工作日左右一个主要里程碑在联络个人化基因组和个人化治疗方面破解生命密码并找到缺点基因对于各种遗传疾病、癌症、肥胖等含有难以估量意义临床基因诊断进展第51页测序技术在临床上应用

肝炎病毒变异、分型检测（HBV）预测一些疾病遗传风险程度（乳腺癌、结肠癌）个体化用药指导（肿瘤化疗用药指导）临床基因诊断进展第52页肝炎病毒变异、分型检测（HBV）核苷类药品干扰素耐药突变点检测LAMADVETVC基因区变异与肝脏疾病严重程度相关与抗病毒治疗效应与肝癌栓塞治疗效应

HBV基因分型可在耐药临床表现发生前1－4个月检测出突变株适时调整用药方案了解病毒在体内存在状态判断肝癌发生风险率存在着天然耐药株HBVDNA阳性临床基因诊断进展第53页乳腺癌(breastcancer)发生于乳腺导管上皮细胞恶性肿瘤是女性常见肿瘤之一,约占全身恶性肿瘤7%-10%全世界每年新发乳腺癌约150万例,死亡约57万例临床基因诊断进展第54页GeneticsBRCA-1BRCA-2P53,Rb-1Her-2/neu,c-erB2,c-myc临床基因诊断进展第55页BRCA1、BRCA2基因突变与乳腺癌经过对有乳腺癌家族史妇女BRCA1和BRCA2基因突变检测显示,这类人群中约有10%为BRCA1和BRCA2基因突变携带者。BRCA1和BRCA2基因突变携带者到70岁时,发生乳腺癌风险累计到达80%-85%,一生中发生乳腺癌风险可高达90%BRCA1和BRCA2基因突变检测是对于有乳腺癌家族史人群进行乳腺癌筛查和早期诊疗有效方法临床基因诊断进展第56页临床基因诊断进展第57页WhatcanYOUdo?1.一侧乳腺癌2.乳腺肿块3.有家族史4.肿瘤标识物临床基因诊断进展第58页每个人是不一样…大多数病人治疗方案是相同…医药费: