临床病原体检测专家讲座

临床病原体检测芮勇宇南方医科大学南方医院检验医学科临床病原体检测第1页某年9月某日晚上某院急诊科来一病人，突然起病，寒战、猛烈头痛、恶心呕吐，面色潮红、眼结膜充血、咳嗽，左耳红肿热痛，体温40℃。案例分析临床病原体检测第2页医生及时抽血进行血液培养，血常规白细胞增高及核左移。初步诊疗败血症，收入院，使用泰能。不过使用泰能3天，病人症状没有改进，血液培养阴性，给家眷下病危通知书。案例分析临床病原体检测第3页请南方医院教授会诊，详细问询病史和仔细体查，得到主要线索，病人一周前爬过白云山，并躺在草地上休息；病人左耳有似被蚊虫叮咬后形成焦痂。案例分析临床病原体检测第4页怀疑恙虫病，外裴试验阳性。恙虫病立克次对头孢菌素类耐药，用四环素类抗生素，1天后退热，继续用药1周，病人康复出院。病原体检测主要性：明确临床诊疗和指导临床用药。案例分析临床病原体检测第5页免疫室：酶链免疫吸附试验（ELISA）、胶体金层析试纸条、化学发光或电化学发光、乳胶凝集方法。检测肝炎病毒、性病、呼吸系统病原体抗原或抗体。检验科三个试验室合作进行病原体检验临床病原体检测第6页基因室：荧光定量PCR方法，定量检测病原体基因。细菌室（重点）：涂片检验、培养判定和药敏试验，检测细菌真菌。检验科三个试验室合作进行病原体检验临床病原体检测第7页第一部分细菌真菌涂片检验及临床意义第二部分细菌真菌培养判定及临床意义第三部分细菌真菌药敏检测及临床意义第四部分临床各科科研工作结合此次课临床病原体检测第8页Part1Morphologicalexaminationsofbacteriaandfungi1non-stained.2gramstain,bacteriaandfungi.3acid-faststain,acid-fastbacillus.4Indianinkstain,cryptococcus.临床病原体检测第9页single-celled,buddingformscalledyeast(spore).multicellular,filamentousformscalledmold(sporeandhypha).dimorphicfungi,existintwodistinctmorphologicforms.

1Non-stained临床病原体检测第10页Skinscraping,nailscraping,andobservationofhairsdirectlybymicroscopyarealsomosthelpfulindiagnosingdermatophyticinfections.Employingadropofpotassiumhydroxide(15%)onaglassslideoverthesurfaceofthespecimen.临床病原体检测第11页hairs临床病原体检测第12页Skinscraping临床病原体检测第13页Routineurineexamination临床病原体检测第14页Basicprinciple？

Procedure？

Peptidoglycan.crystalviolet,iodine,alcohol.carbofuchsinred.Results,G+orG-,cocciorbacillibacteria,fungi,inoilimmersionfield.2Gram-stained临床病原体检测第15页fungiinurine临床病原体检测第16页positiveculturedblood临床病原体检测第17页positiveculturedblood临床病原体检测第18页positiveculturedblood临床病原体检测第19页positiveculturedblood临床病原体检测第20页positiveculturedblood临床病原体检测第21页positiveculturedblood临床病原体检测第22页sputum临床病原体检测第23页sputum临床病原体检测第24页sputum临床病原体检测第25页sputum临床病原体检测第26页sputum临床病原体检测第27页Fungiinleukorrhea,vaginitis临床病原体检测第28页DiplococcusNeisseriagonorrhoeae临床病原体检测第29页Basicprinciple?Procedure?Lipid.

carbolfuchsinred,hydrochloricacid3%alcohol,methyleneblue.Results,acid-fastbacteriared,otherbacteriaandbackgroundblue.3acid-faststain临床病原体检测第30页TheresultreportmodeNegative,acid-fastbacillinotfound,Positive(1or2),1or2wholevisualfield,Positive（+）,3to9wholevisualfield,Positive（++）,10to99wholevisualfield,Positive（+++）,1to9everyvisualfield,Positive（++++）,>10everyvisualfield.

临床病原体检测第31页acid-fastbacillifromsputum（++++）临床病原体检测第32页Cryptococcusincerebrospinalfluid.Basicprinciple,capsule.Procedure,sediment.Results.

4theIndianinkstain

临床病原体检测第33页Cryptococcusneoformans临床病原体检测第34页germinative临床病原体检测第35页临床病原体检测第36页Advantages.cheap,rapid,diagnoseprimarily.Disadvantages.Notaccurate.Part1Morphologicalexaminationsofbacteriaandfungi临床病原体检测第37页第二部分细菌真菌培养判定及临床意义一、血液

二、中段尿

三、粪便

四、痰液

五、咽拭子

六、穿刺液

七、分泌物

八、器械临床病原体检测第38页一、血液病原体检验

EtiologicExaminationofBloodandBoneMarrow目标和意义；采血指征；采血注意事项;结果汇报形式。临床病原体检测第39页

当前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不停增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不停增加。败血症病死率30%以上；早期病原学诊疗和合理抗生素治疗，显著降低败血症病死率。临床病原体检测第40页血液培养送检指征：发烧>38℃或低温<36℃；白细胞增多>10×109/L，“核左移”白细胞增多；粒细胞降低，成熟多核白细胞<1×109/L；血小板降低；皮肤粘膜出血；心率>90次/分；呼吸频率>20次/分；二氧化碳分压<32mmHg；昏迷；多器官衰竭。临床病原体检测第41页最好在抗生素使用前采集，若已用抗菌药须，则尽可能避开血药浓度高峰期，最好在下次用药前。血液标本采集时间临床病原体检测第42页血液标本采集时间临床病原体检测第43页理想状态：在发烧高峰期前半小时，提议第一次可在病人发烧早期或高峰期采集，依据病人发烧情况，在24h内再取2-3次标本，最好每次“双套”“双瓶”，“双套”指不一样采血部位，“双瓶”指树脂瓶和厌氧瓶。血液标本采集时间临床病原体检测第44页临床病原体检测第45页标准血培养瓶（蓝色帽）：帽子和标签纸左上方为蓝色，“Standard10Aerobic/F”，用于成人需氧菌和真菌培养，血液量3-10ml，8-10ml最正确。

临床病原体检测第46页中和抗生素树脂瓶（灰色帽）：帽子和标签纸左上方为灰色，“PLUS+Aerobic/F”，血液量3-10ml，8-10ml最正确。临床病原体检测第47页厌氧瓶（黄色或橘红色帽）：帽子和标签纸左上方为黄色，“StandardAnaerobic/F”，血液量3-7ml，5-7ml最正确。

临床病原体检测第48页中和抗生素儿童瓶（粉红色帽）：帽子和标签纸左上方为粉红色，“PEDSPLUS/F”,血液量1-3ml。临床病原体检测第49页采集标本前先开申请单，到检验科细菌室或门诊领取血培养瓶；采血前先在培养瓶标签纸左侧空白处（箭头所指处）填写抽血时间和病人科别、床号和姓名；不要在培养瓶条形码上涂写，以免影响扫描。临床病原体检测第50页将标签纸上条形码右侧部分（含数字）撕下贴于检验申请单上；而其它标本均是将申请单上双联号码撕下贴于标本上。临床病原体检测第51页注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上；将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内；橡皮塞裸露即可。临床病原体检测第52页细菌室接到已采集血液培养瓶后，马上放入自动血液培养检测仪，自动培养及实时检测。临床病原体检测第53页临床病原体检测第54页阳性初步结果汇报：仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出；取出阳性瓶，对血液涂片及革兰氏染色；马上将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）电话通知对应科室，并在网上发出；利用阳性血液进行K-B法药敏试验，第二天将初步药敏结果电话通知对应科室。结果汇报形式临床病原体检测第55页阳性最终止果汇报：将阳性血液接种血平板培养细菌；第二天将血平板上生长细菌判定及MIC法药敏试验；第三天发判定及MIC法药敏结果正式汇报。阴性结果汇报：如培养5天仍为阴性，再接种血平板培养一天，核实为阴性后再发汇报。结果汇报形式临床病原体检测第56页二、中段尿标本病原体检验

EtiologicExaminationofUrine目标和意义；采集方法;结果汇报形式。临床病原体检测第57页检测泌尿系统感染；普通进行细菌和真菌培养、菌落计数和药敏；也可离心后对沉渣进行涂片检验，革兰氏染色或抗酸染色；也可用于淋球菌培养和涂片检验。目标和意义临床病原体检测第58页最常采集中段尿，晨起第一次尿送检最正确；先用肥皂水、或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最终用灭菌纱布檫拭；排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。采集方法临床病原体检测第59页尿道病原菌可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，不然将影响病原菌计数准确性；排尿困难者可导尿，防止屡次导尿所致尿路感染，导尿包必须为无菌合格产品。采集方法临床病原体检测第60页“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”：如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员指导采集，以降低污染。结果汇报形式临床病原体检测第61页“培养出少许某种细菌、菌落计数结果”：如菌量较少<103ml，但为单一菌种，可能为采集时污染，也可能是真正感染，临床医生可依据病人临床表现判断或再留取标本送检。结果汇报形式临床病原体检测第62页“培养出某种细菌、菌落计数结果、药敏结果”：普通认为细菌或真菌>105／ml，且必须有优势，才能够确定为感染，对优势菌进行判定和药敏。104／ml至105／ml，也有意义。结果汇报形式临床病原体检测第63页三、粪便标本病原体检验

EtiologicExaminationofStool目标和意义：对肠道疾病进行病原学诊疗；涂片染色：查真菌、弧菌、球菌/杆菌比；培养病原菌和药敏：培养沙门氏和志贺菌；培养弧菌；培养真菌；菌群失调病人，对占优势细菌进行判定药敏。临床病原体检测第64页标本采集：挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g；置于清洁容器或置于保留液中送检；排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。临床病原体检测第65页检验上下呼吸道感染痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）；可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌；可进行细菌、真菌或结核杆菌培养；上述检验只要一口痰即可，在一张检验申请单上选上述多个项目。四和五、呼吸道标本病原体检验临床病原体检测第66页采集深部痰（sputum），不是唾液和口水；自然咳痰法(Expectoratedsputum)；最好为清晨第一口痰，用清水重复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内；支气管镜采集法（Bronchoscopy）。采集方法

临床病原体检测第67页报“正常菌群”：培养出均为不致病细菌；培养出细菌种类较多且无优势菌；分离出少许嗜血杆菌,也汇报判定及药敏。结果汇报形式

临床病原体检测第68页报“无菌生长”：病人抗生素使用过分造成；可能病毒、支原体、衣原体等血平板无法培养。结果汇报形式

临床病原体检测第69页报“分离出某种细菌或真菌，百分比，药敏”：分离出致病菌，而不是常见正常菌群，且含有优势，约占血平板菌群总数百分比%；同一病人如痰中连续分离出同一个菌，3天内假如已经做过药敏试验，则不再做药敏；同一病人痰中细菌种类和百分比，会伴随治疗情况改变，也受留取痰标本质量影响。结果汇报形式

临床病原体检测第70页六、穿刺液（脑脊液）病原体检验

Etiologic

ExaminationofCerebrospinalFluid目标和意义：判断是否为感染性疾病脑脊液采集：经过腰椎穿刺术（Lumberpuncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，普通第一管用于微生物学检验；临床病原体检测第71页六、穿刺液（脑脊液）病原体检验

Etiologic

ExaminationofCerebrospinalFluid引发脑膜炎病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集脑脊液应马上保温送检或床边接种;可查普通细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。临床病原体检测第72页其它穿刺液：如胸腹水、关节腔液等，穿刺针注入无菌拭子管送检或将注射器直接送检；如为多管穿刺液或相关组织，请在申请单上注明是否都做培养判定；采集注意事项：注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致；可用血液培养瓶培养。临床病原体检测第73页七、分泌物（伤口或脓液）病原体检验开放性化脓灶：应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸收脓性分泌物；瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再搜集脓汁；临床病原体检测第74页七、分泌物（伤口或脓液）病原体检验封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取；疑为厌氧菌感染者：取脓液后马上排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检；如为液体，最好床旁接种厌氧血培养瓶；外界相通部位标本，如痰不能作厌氧菌培养。临床病原体检测第75页七、分泌物（生殖道）病原体检验

EtiologicExaminationofSTDs性传输疾病，简称性病，是一组经过性行为传输，侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害感染性疾病；标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。临床病原体检测第76页淋病（gonorrhea）涂片染色镜检：急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病女性患者涂片检验漏诊率达40%，故必须同时进行培养。培养判定及药敏结果准确，诊疗金标准。临床病原体检测第77页解脲/人型支原体：细菌室开展了培养判定及药敏方法；需注意是标本采集后应尽快送检。诊疗试剂和方法要符合卫生部相关要求；注意保护病人隐私。临床病原体检测第78页八、器械病原体检验

EtiologicExaminationofotherspecimens静脉插管等标本：放入无菌拭子管中送检；无菌试验：怀疑医疗用具被污染时送检；空气培养：到细菌室取培养平皿置于待测地点，打开平皿盖10min，盖上后送检；医护人员手培养和物表培养：到细菌室取含消毒剂中和液无菌试管，用棉签涂抹后放入试管中送检。临床病原体检测第79页第三部分细菌真菌药敏检测及临床意义药敏结果检验汇报解读，细菌分布及药敏结果分析。临床病原体检测第80页药敏结果检验汇报解读临床病原体检测第81页MIC稀释法（dilutionmethod）K-B纸片扩散法（Kirby-Bauermethod）E-test药敏检测惯用药敏试验方法临床病原体检测第82页K-B法是将含有定量抗菌药品纸片，贴在已接种测试菌琼脂平板上，纸片中所含药品吸收琼脂中水分溶解后，不停向纸片周围扩散形成递减梯度浓度。K-B纸片扩散法药敏试验临床病原体检测第83页K-B法药敏试验不一样抗生素纸片细菌接种于MH平板量取直径临床病原体检测第84页MIC稀释法普通在琼脂或肉汤中将抗菌药品系列对倍稀释，定量接种待检菌，35℃培养18至24小时后观察结果；抑制检测菌肉眼可见生长最低药品浓度，即最小抑菌浓度；MIC稀释法结果以MIC（μg/ml）数值汇报，数值越小越敏感，与K-B法相反；MIC稀释法药敏检测临床病原体检测第85页临床病原体检测第86页稀释法结果比K-B法更准确。本试验室利用细菌自动判定和药敏仪，为稀释法药敏试验，由仪器自动判断药敏结果。药敏检测方法临床病原体检测第87页BDPhoenix100细菌自动判定及药敏分析仪临床病原体检测第88页MIC稀释法药敏判定孔生化试验细菌判定孔临床病原体检测第89页E-test药敏检测结合K-B法和稀释法优点；原理同稀释法检测，操作同K-B法简单；试纸条上含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布某种抗菌药品；主要用于少数抗生素结果验证。临床病原体检测第90页E-test药敏检测临床病原体检测第91页临床试验室标准化委员会（clinicallaboratorystandardsofinstitute,CLSI）标准判断敏感（susceptible，S）：推荐使用；中介（intermediate，I）：药品MIC靠近体液或组织可到达药品浓度，但反应低于敏感株；耐药（resistant，R）；指常规用药剂量不能到达MIC，临床疗效不可靠。药敏检测方法临床病原体检测第92页抗菌药品作用靶位临床病原体检测第93页氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin1代头孢：头孢唑啉Cefazolin2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroximesodium3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime、头孢吡肟（马斯平）Cefepime细菌室药敏试验中常选取抗生素种类临床病原体检测第94页单环β-内酰胺类：氨曲南Aztreonam广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素GPenicillin、苯唑西林Oxacillin抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Piperacillin临床病原体检测第95页复方β-内酰胺类：阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Pioeracillin/Tazobactam头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）efoperazone/Sulbactam碳青霉烯类：亚胺培南Imipenem、美罗培南Meropenem临床病原体检测第96页多肽类：多粘菌素EColistinE、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole林可霉素类：克林霉素Clindamycin大环内脂类：红霉素Erythromycin临床病原体检测第97页氯霉素：氯霉素Chloramphenicol三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin、氧氟沙星Ofloxaxin、左旋氧氟沙星Levofloxacin、莫西沙星Moxifloxacin四环素类：四环素Tetracycline利福平Rifampin临床病原体检测第98页产超广谱β-内酰胺酶(extendedspectrumβ-lactamase，ESBL)：该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类超广谱β-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌等肠杆菌科细