分离分析篇医学知识讲座专家讲座

分离分析篇

SeparationAnalysis中山大学本科教学－仪器分析胡玉玲Tel:84115107-mail:ceshyl@分离分析篇医学知识讲座第1页本章教学要求掌握学习关键点

背公式？会计算？基本概念、理论！会活学活用！广泛阅读

知识面、深度、多学科融会贯通课堂、课外小作业每章小结自愿完成分离分析篇医学知识讲座第2页参考书目卢佩章等编《色谱理论基础》科学出版社（1997）色谱技术丛书：（13册）化学工业出版社汪尔康主编，21世纪分析化学，科学出版社，1999PrinciplesandPracticeofChromatography，RaymondP.W.ScottPracticalHPLCMethodDevelopment，2nd,LloydR.Snyder,JosephL.Glajch,JosephJ.Kirkland,1997俞惟乐等编著《毛细管气相色谱和分离分析新技术》达世禄等编著《色谱学导论》第二版当代分离科学理论导引,高等教育出版社,耿信笃著

年8月生物大分子液相色谱分离和制备,科学出版社,师治贤等编著分离分析篇医学知识讲座第3页国内外色谱主要期刊J.Chromatogr.AandJ.Chromatogr.B（荷兰）Chromatographia（德国）J.ChromatographicSci.（美国）J.Liq.Chrom.&Rel.Technol.J.HighResol.Chromatogr.J.MicrocolumnSep.LC-GCAnalyticalChemistryAnalystTrendinAnalyticalChemistryAnalyticalChemistryActaTalanta《色谱》《分析化学》《高等化学学报》CNKI知识网络服务平台——中国期刊全文数据库

ACS(美国化学学会电子期刊)

SCI（科学引文索引）

RSC（英国皇家化学学会期刊及数据库）

ElsevierScience全文学术期刊

分离分析篇医学知识讲座第4页什么是分离？物质分离是化学中最基本研究伎俩，也是最主要试验技术。

沉淀分离、萃取、柱层析等分离是利用物质物理与化学性质差异来实现。分离非自发过程，在热力学上是受阻，分离过程必须做功分离分析篇医学知识讲座第5页分离定义化工词典：把混合物中一些组分或各组分彼此分开，或把混合物中各相间彼此分开过程叫分离。Separationisanoperationinwhichamixtureisdividedatleasttwocomponentswithdifferentcompositionsortwomoleculeswiththesamecompositionbutdifferentstereochemicalstructure.分离分析篇医学知识讲座第6页分离科学在化学中地位21世纪化学能够定位为“创造和识别泛分子科学”。

－引自徐光宪：从外行人眼里远看“21世纪分析化学”

CASRegNo

登录分子数平均天天增加两万多个，其中识别和创造分子数之比是2:1分离分析篇医学知识讲座第7页制备型分离/纯化分析型分离分离分析按分离目标分类要求高纯度、高回收率产物规模：试验室；生产/工程测定物质结构和性质分离：高纯度；但不一定要求高收率要求“定量”概念，即考虑分离程度完全性；定量分离可能性；简单快速；分离结果含有良好再现性一类仪器分析方法，其特征就是分离分析系统化，即分离过程与检测技术有机结合起来组成一个新型分析技术分离分析篇医学知识讲座第8页分离与色谱

差异大，易分离：如特效化学反应，生物亲和力，用于二元分离差异小，难分离：高效/高性能分离技术，如色谱、电泳，用于多组分分离

色谱法是有符合统计规律数目标分子群在两相间连续屡次分配，利用其分配系数差异来到达分离目标。分离分析篇医学知识讲座第9页主要内容一、色谱学导论二、气相色谱三、高效液相色谱四、毛细管电泳五、色谱分析中样品前处理技术分离分析篇医学知识讲座第10页第一节色谱学导论1.1概述1.2概念和术语1.3基本理论1.4定性定量方法分离分析篇医学知识讲座第11页

序言色谱技术不论是在关乎国计民生问题还是在基础科学研究中都发挥了主要作用。分离分析篇医学知识讲座第12页食品安全问题！三聚氰胺色谱与日常生活分离分析篇医学知识讲座第13页

年3月29日，国家质检总局和国家标准委联合公布了相关苏丹红检测方法国家标准———《食品中苏丹红染料检测方法高效液相色谱法》（GB/T19681-）。标准编号：GB/T5009.192-动物性食品中克伦特罗残留量测定第一法气相色谱—质谱法为0.5μg/kg;第二法高效液相色谱法为0.5μg/kg；第三法酶联免疫法为0.5μg/kg。分离分析篇医学知识讲座第14页色谱与科学研究多维液相色谱与蛋白组学分离分析篇医学知识讲座第15页一个简单试验Asimpleexperimentfromschool1.1

概述分离分析篇医学知识讲座第16页固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚

色带1903年由俄国植物学家Tsweet创建1.1.1

色谱法产生和发展Chromatography

chroma

=

colour graphein=towrite分离分析篇医学知识讲座第17页20世纪40年代纸色谱20世纪50年代薄层色谱1952年James和Martin创造了气相色谱法(主要标志）1957年Golay开创了毛细管气相色谱法20世纪60年代末高效液相色谱20世纪80年代初Jorgenson发展毛细管电泳20世纪90年代毛细管电色谱色谱发展分离分析篇医学知识讲座第18页辛格(RichardSynge)马丁(ArcherMartin)英国生物化学家因为马丁与辛格合作研究创造了一个快速而又经济分析技术，即分配色谱，使化学、医学和生物学研究得到广泛进展。为此，马丁和辛格共同取得了1952年诺贝尔化学奖，时年42岁和38岁。色谱与诺贝尔奖分离分析篇医学知识讲座第19页色谱分析在不一样时期作用30～40年代：为揭开生物世界奥秘，为分离复杂生物组成发挥了他独特作用；60～70年代成为石油化工、化学工业等部门不可缺乏分析监测工具。当前色谱法是生命科学、材料科学、环境科学、医药科学、食品科学、法庭科学以及航天科学等研究领域主要伎俩。各种色谱仪器已经成为各类研究室、试验室极为主要仪器设备。分离分析篇医学知识讲座第20页1.1.2

色谱概念及分离原理

色谱法是一个用来分离分析多组分混合物质方法。其中一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相流体(气体或液体)，称为流动相。Chromatographyisessentiallyaphysicalmethodofseparationinwhichcomponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophase,oneofwhichdoesnotmove(appropriatelycalledthestationaryphase)andtheotherthatmovesthroughitinadefinitedirection(commonlydescribedasthemobilephase).分离分析篇医学知识讲座第21页慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液分离原理：基于各组分在两相之间平衡分配差异。分离分析篇医学知识讲座第22页差异：包含吸附、分配、离子交换、亲和力及分子体积大小分配系数微小差异→微小差异积累→较大差异→与固定相作用弱组分先流出；作用强组分后流出。两相及两相相对运动组成了色谱法基础与适当柱后检测方法结合，实现混合物中各组分分离与检测分离分析篇医学知识讲座第23页色谱法分离过程色谱分离过程是在色谱柱内完成，以气相色谱为例：

当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;

伴随载气不停通入，被溶解或吸附组分又从固定相中挥发或脱附;

挥发或脱附下组分伴随载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;

伴随载气流动，溶解、挥发，或吸附、脱附过程重复地进行。分离分析篇医学知识讲座第24页1.1.3色谱法分类(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。

按分离柱不一样可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相不一样又分为：气固色谱和气液色谱(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相不一样分为：液固色谱和液液色谱。

离子色谱：液相色谱一个，以特制离子交换树脂为固定相，不一样pH值水溶液为流动相。分离分析篇医学知识讲座第25页(3)其它色谱方法薄层色谱和纸色谱：

比较简单色谱方法超临界流体色谱:

CO2流动相毛细管电泳:

1990年代快速发展起来、尤其适合生物试样分析分离高效分离分析技术。分离分析篇医学知识讲座第26页按固定相固定方式分：平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱

填充柱色谱整体柱色谱毛细管柱色谱

分离分析篇医学知识讲座第27页按分离机制分：

分配色谱：利用分配系数不一样

吸附色谱：利用物理吸附性能差异

离子交换色谱：利用离子交换原理

空间排阻色谱：利用排阻作用力不一样按色谱仪使用领域分类分析型色谱制备用色谱仪流程色谱分离分析篇医学知识讲座第28页1.1.4色谱法与其它分析方法比较特点（1）分离效率高复杂混合物、手性异构体等（2）定性困难

光谱、质谱可提供物质结构信息，色谱本质上不具备定性分析功效。（3）联用色谱与光谱、电化学分析、质谱联用是主要发展方向之一。分离分析篇医学知识讲座第29页1.2

色谱学基本概念和术语(1)色谱过程流动相、固定相、溶质样品在柱内运行两个特点：

1.混合物不一样组分在柱内差速迁移；

2.同种组分分子在迁移过程分子分布离散。分离分析篇医学知识讲座第30页1.分配系数(partitionfactor)K

组分在固定相和流动相间发生吸附、脱附，或溶解、挥发过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时浓度比，称为分配系数，用K表示，即：分配系数是色谱分离依据。1.2.1

基本概念分离分析篇医学知识讲座第31页2.分配比

(partitionradio)k分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配到达平衡时质量比：

1、分配系数与分配比都是与组分及固定相热力学性质相关常数，随分离柱温度、柱压改变而改变；

2、分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力参数，数值越大，该组分保留时间越长；

3、分配比能够由试验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)或容量比分离分析篇医学知识讲座第32页容量因子与分配系数关系

式中β为相比，VM为流动相体积，VS为固定相体积容量因子与保留时间关系分离分析篇医学知识讲座第33页1.2.2色谱流出曲线和术语分离分析篇医学知识讲座第34页从色谱流出曲线中，可得许多主要信息：(i)依据色谱峰个数，能够判断样品中所含组分最少个数；(ii)依据色谱峰保留值，能够进行定性分析(iii)依据色谱峰面积或峰高，能够进行定量分析；(iv)色谱峰保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能依据；(v)色谱峰两峰间距离，是评价固定相（或流动相）选择是否适当依据。

分离分析篇医学知识讲座第35页1、基线

无试样经过检测器时，检测到信号即为基线。2、峰高色谱峰顶点与基线之间垂直距离，以（h）表示。3、峰面积色谱曲线与基线包围面积信号进样空气峰色谱峰峰高h基线a分离分析篇医学知识讲座第36页4保留值

(1)

死时间t0

不被固定相吸附或溶解物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需时间称为死时间，它正比于色谱柱空隙体积，以下列图。

信号进样t0测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与t0比值计算，

ū=L/t0分离分析篇医学知识讲座第37页(2)

保留时间tr

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过时间，称为保留时间。信号进样tr(3)

调整保留时间tr

´

tr

´=tr

t0

因为组分在色谱柱中保留时间tr包含了组分随流动相经过柱子所须时间和组分在固定相中滞留所须时间，所以tr实际上是组分在固定相中保留总时间。tr´分离分析篇医学知识讲座第38页

（4）用体积表示保留值保留体积（VR）：

VR=tR×F0F0为柱出口处载气流量死体积（Vo）：

V0=t0×F0调整保留体积(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

分离分析篇医学知识讲座第39页5、相对保留值α

组分2与组分1调整保留值之比：

α=t´R2

/t´R1=V´R2/V´R1

相对保留值只与柱温和固定相性质相关，与其它色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分选择性。分离分析篇医学知识讲座第40页6、区域宽度

用来衡量色谱峰宽度参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度二分之一。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高二分之一处宽度Y1/2=2.354

（3）峰底宽(Wb)：Wb=4

分离分析篇医学知识讲座第41页7、分离度定义：两倍峰顶距离除以两峰宽之和。

2（tR（2）-tR（1））

R=——————————W（1）+W（2）

N1/2

-1

kR=——（——）（——）

4

k-1最正确分离度：流出峰相隔足够远——色谱热力学原因峰宽应尽可能窄——色谱动力学原因分离分析篇医学知识讲座第42页色谱分离中四种情况如图所表示①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,但分离不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。分离分析篇医学知识讲座第43页R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离标准）。分离分析篇医学知识讲座第44页影响分离度原因分离度与柱效关系当物质对和固定相确定时：分离分析篇医学知识讲座第45页分离度与容量因子关系分离度与选择因子关系

α=1.0时，R=0

α微小改变就能引发分离度显著改变主要经过改变固定相和流动相实现分离分析篇医学知识讲座第46页色谱基本概念小结需掌握：1.什么是死时间？保留时间？调整保留时间？2.分配系数与容量因子区分，分别受哪些原因影响？3.色谱分析依据什么定性、定量？4.相对保留值α和分离度R概念有何不一样？它们分别受哪些原因影响？分离分析篇医学知识讲座第47页1.3、基本理论色谱理论需要处理问题：色谱分离过程热力学和动力学问题影响分离及柱效原因与提升柱效路径柱效与分离度评价指标及其关系组分保留时间为何不一样？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程热力学原因控制；

(组分和固定相结构和性质)

色谱峰变宽：色谱过程动力学原因控制；

(两相中运动阻力、扩散)两种色谱理论：塔板理论和速率理论；分离分析篇医学知识讲座第48页塔板理论假设：在每一个平衡过程间隔内，平衡能够快速到达(2)将载气看作成脉动（间歇）过程(3)试样沿色谱柱方向扩散可忽略(4)每次分配分配系数相同1.3.1、塔板理论

（1）塔板理论(platetheory)

一个半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续色谱分离过程分割成屡次平衡过程重复(类似于蒸馏塔塔板上平衡过程)；分离分析篇医学知识讲座第49页分离过程以下列图所表示分离分析篇医学知识讲座第50页分离分析篇医学知识讲座第51页色谱流出曲线数学描述

色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上浓度与时间关系为：

当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。分离分析篇医学知识讲座第52页HH/2WH/2开始tR（2）塔板数和塔板高度分离分析篇医学知识讲座第53页

单位柱长塔板数越多，表明柱效越高用不一样物质计算可得到不一样理论塔板数组分在t0时间内不参加柱内分配，需引入有效塔板数和有效塔板高度：分离分析篇医学知识讲座第54页（3）塔板理论特点和不足

(1)对色谱流出曲线分布形状和谱带移动规律给于近似解释

(2)

提出了计算和评价柱效高低参数。当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配次数越多，柱效能则越高。

(3)

塔板理论没有将理论塔板高度与色谱参数定量联络起来。

(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不一样流动相流速下柱效不一样试验结果。分离分析篇医学知识讲座第55页(4)塔板理论假设错误假设中忽略了分子纵向扩散作用是不合理分配系数不随溶质浓度改变而改变假设只能在一定浓度范围内成立假设流动相运动是跳跃式，不连续，这于实际色谱过程完全向背离分离分析篇医学知识讲座第56页1.3.2、速率理论（1）速率方程（也称范.弟姆特方程式）

H=A+B/u+Cu

H：理论塔板高度，

u：流动相线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提升柱效；存在着最正确流速；

A、B、C三项各与哪些原因相关？分离分析篇医学知识讲座第57页A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相平均颗粒直径

λ：固定相填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引发色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。分离分析篇医学知识讲座第58页B/u

—分子扩散项

B=2νD

ν：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。

D：试样组分分子扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)分子扩散项与流速相关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(3)与温度相关，温度↑，扩散↑(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓

(5)对于液相色谱，组分在流动相中纵向扩散能够忽略分离分析篇医学知识讲座第59页

k为容量因子；dp为担体粒度；df为液膜厚度；Dg

、DL为扩散系数。

减小担体粒度，选择小分子量气体作载气，可降低传质阻力。Cu—传质阻力项

气液色谱：传质阻力包含气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：

C=（Cg+CL）分离分析篇医学知识讲座第60页液相色谱：传质阻力系数（C）包含流动相传质阻力系数（Cm）和固定相传质阻力系数（Cs），即

C=Cm+Cs

Cm=

mdp2/Dm+

smdp2/Dm与固定相粒度dp平方成正比，与试样分子在流动相中扩散系数Dm成反比，ωm是由柱和填充性质决定因子。

分离分析篇医学知识讲座第61页液相色谱速率方程

2

Dmqk

df2

f(k

)dp2Cmsdp2H=2

dp+

———

+(

————+——————+————)u(1+k

)2Ds

DmDm固定相粒度愈小，微孔孔径愈大，填充越均匀，柱效就高。对高效液相色谱固定相设计就是基于这一考虑。分离分析篇医学知识讲座第62页(2)GC和LCH-u图（VanDeemter曲线）分离分析篇医学知识讲座第63页气相色谱载气流速与柱效——最正确流速载气流速高时：传质阻力项是影响柱效主要原因，流速

，柱效

。载气流速低时：分子扩散项成为影响柱效主要原因，流速

，柱效

。H-u曲线与最正确流速：

以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点流速即为最正确流速。分离分析篇医学知识讲座第64页(3)速率理论关键点

(1)组分分子在柱内运行多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成分子扩散及传质阻力使气液两相间分配平衡不能瞬间到达等原因是造成色谱峰扩展柱效下降主要原因。

(2)经过选择适当固定相粒度、流动相种类及流速可提升柱效。

(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。说明了流速和柱温对柱效及分离影响。

(4)各种原因相互制约，如流动相流速增大，分子扩散项影响减小，使柱效提升，但同时传质阻力项影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散影响，选择最正确条件，才能使柱效到达最高。分离分析篇医学知识讲座第65页色谱基础理论小结塔板理论和速率理论各有何特点？依据速率理论方程，色谱填料粒径、填充均匀性、载气种类、流速、分离温度等条件是怎样影响柱效？分离分析篇医学知识讲座第66页1.4

色谱分析方法建立1

选择适当仪器

GCorHPLC检测器色谱柱2

对样品进行适当前处理3

分离条件优化4

色谱定性、定量分析分离分析篇医学知识讲座第67页1.4.1色谱定性分析

（1）利用纯物质对照定性保留时间或保留距离定性。

适合用于组分性质已经有所了解，组成比较简单，有纯物质未知物。分离分析篇医学知识讲座第68页分离分析篇医学知识讲座第69页（2）加入已知物增加峰高法（3）保留值经验规律定性法

碳数规律：

lgtR=A1+B1n分离分析篇医学知识讲座第70页（4）保留指数定性法

保留指数也是一个相对保留值，它是把正构烷烃中某两个组分调整保留值对数作为相正确尺度，并假定正构烷烃保留指数为n100。被测物保留指数值可用内插法计算。

(5)双柱、多柱定性分离分析篇医学知识讲座第71页

（6）与结构分析仪器联用定性红外光谱、质谱、核磁共振、元素分析

离线：

LC样品搜集：挥发性溶剂，易去除缓冲液。

GC样品搜集：低温冷阱、低温吸附或溶剂溶解。

IR-KBr粉末吸收

在线：GC-MS;LC-MS.分离分析篇医学知识讲座第72页1.4.2

色谱定量分析（1）峰高、峰面积对称形峰面积测量——

峰高乘以半峰宽法不对称形峰面积测量——

峰高乘平均峰宽法。自动积分：基线较平，分离很好。手动积分：基线波动较大。分离分析篇医学知识讲