植物产品品质分析

第第页植物产品品质分析5.1蛋白质和氨基酸的测定蛋白质是生命的物质基础，它的含量是衡量农、畜、水产品品质的紧要指标，在育种、食品和饲料等工作中常常需要测定蛋白质的含量。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，也是蛋白质的分解产物。全氨基酸和个别氨基酸的分析测定是讨论蛋白质、酶的化学构成及性质的紧要手段。生物学及农业科学的很多领域都需要分析氨基酸。在评价谷物的蛋白质营养价值时需要测定游离氨基酸及蛋白质的氨基酸构成，动植物产品中的氨基酸以多种形式存在，大致可分为两种，即构成蛋白质的氨基酸和游离的氨基酸，另外，还有少量的由肽键连接的几个氨基酸，以及与糖或脂结合在一起的，在入类和动物营养学上，各种氨基酸含量的高处与低处是很紧要的，特别是有几个限制性氨基酸，如称为“**、**限制氨基酸”的赖氨酸和色氨酸，是必需氨基酸，即必需从食物中直接汲取，而不能由入与动物利用食物中的其它成分自身合成，却又对入和动物的生长发育起侧紧要作用的氨基酸；若缺乏这些氨基酸，入和动物不仅不能正常发育，还会引起某些**，而这些氨基酸在贮存和加工的过程中极易损失破坏，因此它们的实际含量已成为衡量谷物、饲料蛋白质的紧要标准之一5.1.1蛋白质的测定蛋白质的分析方法很多，可分为两类，即间接法和直接法。间接法是利用蛋白质中含有肯定量的氮，通过测定样品中的含氮量再乘以换算系数，计算出蛋白质的含量，如开氏法；直接法是依据蛋白质的理化性质，测定蛋白质的方法，如染料结合法、双缩脲法和萤光法等，*常用的方法是开氏法，但开氏法测定的氮中还包含有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，故称由此而计算出的蛋白质为“粗蛋白质”。假如蛋白质用重金属盐等沉淀分别以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。开氏法是测定全氮量的经典方法，被用于测定各种形态的有机氮。由于设备简单易得，结果牢靠，为一般试验室所采纳。开氏法测定籽粒中粗蛋白质的方法原理是，依据同类植物籽粒中蛋白质的含氮量基本上是固定不变的。氮是蛋白质中的重要成分。因此，可用开氏法消煮定氮（参见土壤全氮的测定），再将测得的含氮值乘以蛋白质换算系数，即得粗蛋白质含量。氮含量换算成蛋白质的系数，一般采纳6.25，这是由蛋白质平均含氮16％为依据导出的值，但不同植物籽粒中蛋白质的含氮量有差异，故由氮换算为蛋白质的因数也稍有不同，如大麦、黑麦、燕麦籽粒的系数为5.83、大豆5.71、其他豆类6.25、但开氏法操作手续较繁，分析的速度较慢，试剂费用较高。近年，已经显现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自动的开氏定氮仪、蛋白质分析仪。这些仪器虽然自动化程度较高，但价钱昂贵。在生产和科研工作中，为了完成大批样品的分析，需要采纳快速、简易的分析方法，例如染料结合法、双缩脲法、水合茚三酮法、亮磺化黄素萤光法、红外光谱法、核磁共振法、测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝比色法法和纳氏比色法。5.1.2同类种子中蛋白质的测定（染料结合法，DBC法）方法原理蛋白质中的碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）的—NH2、咪唑基和胍基，以及蛋白质未端自由氨基在pH2～3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如桔黄G，酸性橙12等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质—染料络合物而沉淀下来。通过测定肯定量样品与肯定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中，蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高处与低处。假如要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需要用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归曲线得到粗蛋白质了。若只需比较蛋白质含量的高处与低处（如在筛选同种作物种子的大批样品时），则不必知道蛋白质的**含量，而只要测定样品的染料结合量即可进行比较。此法简单、快速，与开氏法的相关性较好但精准性较差，适用于大批样品的筛选工作。操作步骤1.样品的测定称取0.25mm筛子的谷物样品0.2～0.7g（x.xxx），放入30mL试管中，加入染料溶液20mL，盖紧试管口，振荡60min，使样品和染料溶液充分反应，取反应后的浑浊液（8～10mL即可）注入离心管中以3000rmin—1的速度离心8～12min，至上部溶液澄清为止，以下操作步骤同标准曲线。2.标准曲线与样品测定的同时，取1000mgL—1的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放入100mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为100、300、500、600、700、800mgL—1的染料标准溶液，可用GXD—201型蛋白质分析仪测定，绘制标准曲线；也可以把染料溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色槽和482nm的波长测定，绘制标准曲线。3.回归方程选取粗蛋白质含量从低到高（如小麦种子粗蛋白质含量可从7～17％）的同一类谷物样品35个左右，用开氏法测其粗蛋白质，并用上述方法测定各样品的染料结合量。依据所得的结果，计算出染料结合量与蛋白质之间的回归方程。从测得的未知样品的染料结合量，求出蛋白质的含量。结果计算样品的染料结合量B=V*10—3*（C0—C）/m式中：B：每克样品所结合的染料的毫克数mgg—1；V：加入染料溶液的总体积mL；10—3：将mL换算成L的系数C0：染料溶液的初始浓度，mgL—1；C：染料结合反应后残余溶液中的染料浓度，mgL—1；m：样品的质量，g。注意事项1.在偶氮磺酸染料中，除桔黄G外，也可以使用酸性12（AcidOrangel2，缩写AO12，C16H11O4N2SNa，分子量305.37），它的分子结构与桔黄G基本相同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺酸基，即一个结合碱基的位置（桔黄G二个），后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是桔黄G的两倍。故其更适合于在染料结合法中应用，它们在482nm左右有一个较宽的汲取峰，便于比色测定。2.样品称样量按蛋白质含量的高处与低处而定，水稻、小麦、大麦等样品可称取0.5g，玉米称取0.7g，大豆称取0.2g，花生及鱼粉等可少一些。3.染料结合反应的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反应的时间和温度等都会影响测定的结果，故每次测定应力求反应条件一致，特别是在测定样品与测定回归方程的样品时，反应条件尤需一致。5.1.3氨基酸的测定氨基酸分析包括测定氨基酸的总含量及氨基酸中每个氨基酸的含量两个方面。测定氨基酸总量的方法与蛋白质分析有紧密的关系，很多测定蛋白质全氮含量的方法如开氏定氮法及各种比色法均可用于测定氨基酸的总含量。此外，测定氨基酸总含量的方法还有氨基氮的甲醛滴定法，测定ａ—氨基氮的范司克莱法及茚三酮比色法等。近代进展起来的各种色谱法是分析全氨基酸的有力工具。薄层层析是60时代进展起来的分析方法，它操作简便、设备简单、层析速度快、灵敏度高，已广泛应用于分别和测定氨基酸。近二十年来，应用气相色谱法分析氨基酸已进行了大量的工作。气相色谱法具有分析速度快、灵敏度高的特点，仪器的成本也比氨基酸自动分析仪低。尤其是在分析氨基酸的对映异构物及超微量（ng）样品时，气相色谱有特别的作用。氨基酸自动分析仪是应用*广泛的分析氨基酸的专用仪器5.1.3.1谷物和饲料中赖氨酸的测定[染料结合法（DBL法）]赖氨酸是一种入与动物必需氨基酸，缺乏赖氨酸不仅不能正常发育，还会引起某些**。在绝大多数谷物中，赖氨酸是*缺乏的氨基酸，被称为“**限制氨基酸”。它在谷物贮存、加工过程中，又很不稳定，易于脱去氨基、被氧化或是发生变质而损失破坏，或变成营养上的“无效”。因此赖氨酸的实际含量已成为衡量谷物、饲料蛋质白品质的紧要指标。测定赖氨酸的方法很多，属于化学的方法有2，4，6，三硝基苯磺酸（TNBS法），1—氟2，4—二硝基苯法（FDNB法）和2—氯—3，5—二硝基吡啶法（CNPY法）等，这些方法的共同缺点是操作手续冗长费时，还需要某些特别的试剂，不适用于成批样品的分析。离子交换色谱法（氨基酸自动分析仪法）仍被认为是标准法，但仪器昂贵不能普及。现在国内外应用较广泛的是简便易行的赖氨酸测定法。方法原理染料结合法可用于测定样品中蛋白质的碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。假如先将样品用丙酸酐处理，丙酸酐便将赖氨酸的—NH2酰化掩蔽，使其失去了和染料结合的本领。然后，分别测定酰化前后的DBC值。酰化前的测定值为赖氨酸、组氨酸、精氨酸的总和。而酰化后只是组氨酸和精氨酸，以上两项测定结果的差值，就可计算出赖氨酸的含量。操作步骤1.标准曲线配制浓度分别为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9mmolL—1的标准溶液（工作液）。吸取各工作液20.00mL分别加入半饱和乙酸钠溶液2.00mL及磷酸盐缓冲液0.20mL，充分混匀，在GXD—201型蛋白质分析仪上测定，绘制工作曲线。也可以用磷酸盐溶液稀释50倍后，用0.5cm比色槽和482nm波长，以分光光度计测定，绘制工作曲线。2.样品的测定称取0.1xx～0.8xxg（因样品蛋白质含量高处与低处而定）已粉碎过60目筛四份，供制酰化和不酰化样品各两份。分别加入30～35mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的试管中，标明为A、B管（酰化样品）和C、D管（不酰化样品）。同时应另称样品测定水分含量。（1）丙酰化反应各管分别加入160gL—1乙酸钠溶液2.00mL，然后加丙酸酐0.20mL于A、B管中，加磷酸盐缓冲溶液0.20mL于C、D管中。盖紧塞子，放置在往复振荡机上振荡10min。（2）染料结合反应向A、B、C、D管中各加入染料溶液20.00mL，盖紧塞子，置于振荡机上振荡1h，使染料结合反应达到平衡。（3）离心将以上反应液在3000～4000rmin—1下离心10min。（4）测定在GXD—201型蛋白质分析仪或分光光度计上测测。结果计算赖氨酸％（干基）={[3.89—（1.11*CC.D）]/mC.D—[3.89—（1.11*CA.B）]/mA.B}*20/1000*146.2/1000*100式中：CA.B、CC.D：各为酰化与不酰化样品的剩余染料溶液浓度，mmolL—1；mA.B、mC.D：各为酰化与不酰化样品质量，g；20：为加入染料溶液量，mL；1.11：为（20+2+0.2）与20之体积比；3.89：酸性橙红染料溶液初始浓度，mmolL—1；146.2：赖氨酸的摩尔质量，gmol—1、5.2碳水化合物的分析碳水化合物是绿色植物光合作用的重要产物，又是入类和动物体能量的重要来源，它在新陈代谢中起侧紧要的作用。在植物整个生命活动中碳水化合物是仅次于蛋白质、氨基酸的另一类紧要物质，在农产品评价利用中，很多都与碳水化合物紧密相关。碳水化合物重要包括水溶性糖、淀粉、纤维索等。农产品中的水溶性糖重要有单糖（葡萄糖和果糖）及双糖（蔗糖），由于它们都溶于水也溶于酒精，统称水溶性糖或可溶性糖。其分析意义，可分为三类：①为讨论植物不同生长期体内碳氮代谢；②分析水果、蔬菜中糖分，以评价其品质及其在贮运过程中含糖量的变化；③对甜菜、甘蔗等糖用作物以及动物饲料中糖的分析等以鉴定其质量。由于样品中糖分的构成、含量不同和精度要求的不同，应选择不同方法进行分析。淀粉作为植物的贮藏物质，大量地存在于禾谷类作物种子和薯类作物块根、块茎中，例如禾本科种子中淀粉含量可高达于重的50～80％，块根、块茎中可达鲜重的20～30％。淀粉是人们食品及家畜、禽饲料的重要成分，也是食品加工工业及轻工业的紧要原材料之一，对它们的分析，无疑是非常紧要的。纤维素是植物细胞壁的重要成分，它常和半纤维索及木质素在一起，是碳水化合物中较难分解的成分。现代医学认为，纤维素有助于肠的蠕动作用，因而对入类健康大有裨益，主张多食用富含纤维索的果蔬类；而饲料中纤维素含量又和粗、精饲料的搭配有关，所以分析纤维素对食品及饲料皆有紧要意义。5.2.1水溶性糖的测定农产品中水溶性糖包括单糖（葡萄糖、果糖）、双糖（蔗糖）。单糖是指用水解方法不能加以分解的碳水化合物，具有还原的特性，称为还原糖；蔗糖不具有还原性，称非还原糖。但蔗糖（双糖）经水解为单糖后，也具有还原性，糖的还原性质与测定方法紧密相关。测定水溶性糖首先须用水（80ºC）将其从试样中浸提出来；也可以用乙醇浸提，后者是在样品中含有大量淀粉和菊糖时采纳。双糖须经水解转化为还原糖后再测定。测定还原糖的方法很多，有质量法、容量法、比色法及旋光法等。重量法是以还原糖将费林试剂还原产生Cu2O称其质量为基础的经典法。容量法按所用氧化剂不同可分为铜还原法和铁还原法两类，前者常用费林试剂为氧化剂；后者用铁氰化盐的碱性溶液为氧化剂。还原糖与氧化剂的反应很多而杂，常随反应条件（如加热温度和时间、试剂的浓度和碱度以及糖的浓度）而更改，不能按单一的反应式来定量计算。因此全部的测定方法都是通过试验所得的阅历式或查阅历表来计算结果的。所以测定时必需极严格地遵奉操作规程进行，否则将产生相当大的误差。铜还原—直接滴定法，操作简便，适用于含糖量较高瓜果、蔬菜等样品；铜还原碘量法（半微量法），适用于含糖量低的牧草、蔬菜等样品。另外，水溶性糖总量（包括还原糖和非还原糖），可以在浸提后经稀HCl转化测定水溶性糖总量。蔗糖含量可从水溶性糖总量减去水解前还原糖含量乘以0.95系数而求得。测定糖用作物（甘蔗、甜菜）中蔗糖的含量多用旋光法。5.2.1.1单糖（还原糖）的测定铜还原—直接滴定法（常量法）方法原理用待测液滴定肯定量的费林试剂，依据肯定量的费林试剂所消耗的标准葡萄糖量，计算出待测液中的还原糖的含量。还原糖与费林试剂的作用如下：①费林试剂（A）与（B）等体积混合后，产生下列反应，形成铜的酒石酸络盐：Cu2＋＋2OH—十2C4H4O62—→[Cu（C4H3O6）2]4—+2H2O②在煮沸的条件下，铜的酒石酸络盐与还原糖作用，将还原糖氧化和降解：6[Cu（C4H3O6）2]4—+CH2OH（CHOH）4CHO+2OH—+4H2O→3CuO↓+CH2OH（CHOH）3COOH+CO3—+12C4H4O62—在用待测液滴定肯定量的费林试剂时，以亚甲基蓝作为氧化还原指示剂。在滴定过程中，稍过量的还原糖可使氧化型亚甲基蓝的蓝色消失还原成无色的还原型亚甲基蓝，即达滴定点。还原糖与费林试剂反应的完全程度与滴定时的条件（如加热强度、温度、时间等）有关，必需严格依照规程操作。由于指示剂也能消耗肯定量还原糖，所以每次滴定时须按规定加入相同数量的亚甲基蓝。本法适合于含糖量高的样品（15～50mL待测液中含糖50mg）。操作步骤1.待测液制备（1）水提取法：**新鲜水果、蔬菜样品外来污染的杂质，尽可能快地磨细或切碎，混匀，称取样品25.00～50.00g（含糖约2.5g），置高速组织捣碎机中，加适量水后捣碎（或置研钵中加少量纯石英砂共同研磨），然后当心移入250mL容量瓶中，加水至约150mL；或已风干磨细的样品则可称取0.500～5.00g，洗入250mL容量瓶中，亦加水至约150mL。然后加入粉状CaCO30.5～1.5g中和样品中的酸（防止浸提过程中蔗糖水解），摇动1min，置于80℃水浴中保温浸提30min，其间摇动数次以利糖分浸提完全。冷却，滴加中性乙酸铅溶液至产生白色絮状沉淀（约2～5mL），充分摇动混合，静置15min，再滴加几滴中性乙酸铅溶液于上部清液中检查是否沉淀完全。假如还有沉淀形成，再摇动，静置，直至不产生白色絮状沉淀为止，用水稀释定容。用干滤纸过滤。加入足量固体草酸钠到滤液中，使铅沉淀完全，再用干滤纸过滤，再加少许固体草酸钠到滤液中，检查铅是否沉淀完全，确认无铅后，滤液待用。（2）乙醇提取法：称取剪碎、混匀的新鲜植株样品（含大量淀粉或菊糖的样品）25.00g或干样0.500～5.00g，放入400mL烧杯中，加入85％乙醇150mL浸泡过夜（另测样品水分），倒入高速组织捣碎机的杯中捣碎，再倒回原烧杯中，用80％乙醇将杯壁上的样品洗净，一同倒入烧杯中，过滤入250mL容量瓶中，再用80％乙醇少量多次洗涤残渣，直至滤液无糖反应为。*后以80％乙醇定容。吸取乙醇浸出液25.00～50.00mL（吸取量视含糖量与方法而定），放入瓷蒸发皿中，如溶液呈酸性，用固体CaCO3中和，在60～80℃水浴上蒸干乙醇后，加入少量无CO2水，用橡皮头玻棒将干物质洗下，边搅边加入Ba（OH）2饱和溶液2～10mL，至溶液呈淡黄色（碱性），此时絮状蛋白质沉淀物浮在液面。加入酚酞指示剂1滴，在不断搅动下加入硫酸锌溶液以沉淀过量的Ba2+，直到溶液呈微红色时为止。过滤入50mL容量瓶中，用少量水洗涤沉淀后定容，待测。2.还原糖测定（1）约测：精准吸取费林试剂（A）和B各5mL（或吸取混合费林试剂10mL），放入250mL角瓶中，由滴定管加入待测液约15mL，置于石棉网上用酒精灯加热、煮沸，趁沸连续滴加待测液，滴加速度约为10～15s之内加入1mL直至溶液蓝色即将消失，加入亚甲基蓝指示剂3滴，连续滴加待测液，直至蓝色褪尽为止，记下待测液的用量（mL）。（2）准测：精准吸取费林试剂（A）和（B）各5mL（或吸取混合费林试剂10mL），放入250mL角瓶中，加入待测液，其用量比约测时滴定量约少0.5～1.0mL，置于石棉网上用酒精灯加热、煮沸，使之2min内沸腾，维持沸腾2min后，加入亚甲基蓝指示剂3滴，再逐滴地加入待测液，直至蓝色褪尽。前后总沸时间为3min。精准记下待测液的消耗量（V1），待测液的消耗量须在15～50mL范围内（含糖量近50mg），否则应加添或削减称样量，重新制备待测液。3.费林试剂的标定同上操作条件，用葡萄糖标准溶液也分“约测”及“精准测定”两步进行。精准记下消耗标准糖液用量（V0）（测定3次取平均值）。结果计算还原糖，%=C*V0*V*10—3/（m*V1）*100式中：C：糖标准溶液浓度，mgL—1；V。：滴定10mL费林试剂所消耗标准葡萄糖液的量，mL；V：滴定10mL费林试剂所消耗待测液的量，mL；V1：待测液的总体积，mL；10—3：将mL换算成L的系数；m：样品质量，g。注意事项无色的还原型亚甲基蓝极易被大气中的O2所氧化，恢复原来的蓝色，故整个滴定过程中三角瓶不能离开灯火，使瓶中的溶液始终保持沸腾状态，液面覆盖水蒸汽，不与空气接触。铜还原碘量法（半微量法）方法原理索姆吉试剂与还原糖作用生成Cu2O沉淀，将沉淀用H2SO4酸化时，Cu2O即溶解成Cu+，而索姆吉试剂中的KIO3与KI在酸化时生成I2：KIO3+5KI+3H2SO4→3K2SO4+3H2O+3I23CuO↓试剂中的KIO3是定量加入的，所以生成的I2也是肯定量的。生成的I2与Cu+发生氧化还原反应，消耗一部分I2：2Cu++I2→2Cu++2I—溶液中与Cu+反应后所剩余的I2以淀粉为指示剂，用Na2S2O3标准溶液滴定：I2+2S2O32—→S4O62—+2I—在测定同时做空白标定，以水代替糖试液。由空白标定消耗的Na2S2O3毫升数减去实测待测液消耗的Na2S2O3毫升数，通过查表即得待测液中还原糖的毫克数。本方法适用于含糖少的蔬菜、牧草等样品。操作步骤1.糖溶液的提取同铜还原—直接滴定法。2.还原糖的测定。吸取5mL（约0.5～2.5mg还原糖）待测液放入25x200mm试管中，加索姆吉试剂5mL，摇动混匀。试管口盖以漏斗，在沸水浴中加热15min，当心将试管平稳地置于流动冷水浴中4min；去盖，沿管壁加入KI—K2C2O42Ml（溶液为碱性时不要摇动）及硫酸溶液3mL，充分摇动混匀，使CuO完全溶解；再于冷水浴中放5min，并摇动2次，然后用硫代硫酸钠标准溶液滴定，至浅黄色时，加入淀粉5～10滴为指示剂，连续滴定至蓝色消失为尽头。按同样的操作进行空白标定。由空白标定与样品测定所用毫升数之差，从表查得相当的还原糖毫克数，用已知量的标准糖溶液同样进行测定，可以校验表的数值。结果计算还原糖，％=m1*10—3/m*100式中：m1：查表所得还原糖质量，mg；10—3：将mg换算成g的系数；m：吸取的待测液中相当的样品质量，g。两次平行测定结果允许相对偏差为5％。5.2.1.2水溶性总量和蔗糖的测定植物水溶性糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖。其中，蔗糖须经稀HCl水解生成转化糖（生成等量的葡萄糖和果糖）后与其它的还原糖一起测定，即为水溶性总糖。蔗糖的含量用差减法计算出。计算式如下：蔗糖％=（水溶性糖总量％—还原糖％）*0.95式中：0.95为还原糖转化为蔗糖的因数。5.2.1.3糖料作物中蔗糖的测定（旋光法）糖料作物重要指甘蔗和糖用甜苹等，它们所含糖分几乎全是蔗糖，前者可直接压汁测定蔗糖含量，后者则须用水浸提后测定。测定蔗糖的的方法有旋光法、折光法和容量法等，其中广泛采纳的是旋光法，其特点是简单、快速、精准，但需用旋光计或检糖计。比重法和折光法不够精准。没有检糖（旋光）计时，可以选用适于常量测定的化学方法，例如，蔗糖经HCl水解转化后，用铜还原—直接滴定法测定还原糖，再计算蔗糖的含量。旋光法测糖的原理是基于糖类分子具有不对称碳原子，可使通过的光的偏振面旋转。当光的波长、温度和液层厚度肯定时，溶液中蔗糖的浓度与偏振光面旋转角度成正比，因此，可用旋光计或检糖计测定蔗糖的含量。各种糖类都有其特定的比旋，例如蔗糖水溶液的比旋为+66.5，葡萄糖是+52.8，果糖是—92.8，麦芽糖是+118等。5.2.3淀粉的测定淀粉可直接被酸水解生成葡萄糖；或被酶水解生成麦芽糖和糊精，再经酸水解生成葡萄糖，可测定葡萄糖含量（还原糖）再计算出淀粉含量。酸水解法不仅使淀粉水解，而且也能分解半纤维素，结果产生了具有还原力的木糖、阿拉伯糖等单糖，使淀粉测定结果偏高。另外，淀粉经分散和酸解后具有肯定的旋光性，也可用旋光法测定淀粉含量。淀粉是多糖聚合物，可用CaCl2—HOAc（相对密度1.3，pH2.3）为分散和液化剂，在肯定的酸度和加热条件下，使淀粉溶解和部分酸解，生成具有肯定旋光性的水解产物，可用旋光计测定。用此法时，各种淀粉的水解产物的比旋指定为203、国内谷物淀粉分析方法标准化讨论协作组认为，本法结果的重复性好，操作简便、快速。上带有空气冷凝管的塞子，使淀粉经酶水解生成的糊精和麦芽糖再经酸水解为葡萄糖。5.2.4粗纤维的测定（酸性洗涤剂法，ADF）长期以来，测定粗纤维常用酸（H2SO4）碱（NaOH）交替浸煮法。该法操作手续冗长，测定条件不易掌控，而且试样经沸热NaOH溶液处理时，木质素有不等比例的溶解，使粗纤维的测得值偏低，从而使“无氮浸出物”含量偏高。酸性洗涤剂法（ADF）操作简便，是一个快速的方法。测得的“酸—洗涤剂纤维”较前法为高。酸—洗涤剂法对纤维素的回收率以及它的结果与样品的消化率之间相关系数都高于前法。采纳酸性洗涤剂法，必要时还可以接着分别测定酸不溶性木质素。此法现已得到美、英等国的公认。方法原理季按盐（例如十六烷基**基溴化铵（CTAB），是一种表面活性剂，在硫酸溶液（0.5molL—1）中能有效地使动物饲料、植物样品中蛋白质、多糖、核酸等组分水解、湿润、乳化、分散，而纤维素及木质素则很少变化。酸—洗涤剂法就是利用这个原理，将试样用CTAB的H2SO4溶液（酸—洗涤剂）煮沸1h，过滤，洗净酸液后烘干，依据残渣的质量计算酸性洗涤剂纤维（％）。本法适用于谷物及其加工品、饲料、牧草、果蔬等植物茎秆，叶、果实以及经测定粗脂肪后的任何试样中粗纤维的测定。操作步骤称取通过1mm筛的风干试样1.000g或相当量的鲜样，放入250mL三角瓶中，在室温下加入酸性洗涤剂溶液100mL加热，使之在5～10min内煮沸。刚开始沸腾时计算时间，装上冷凝管回流60min。注意调整加热温度，使整个回流过程始终维持微沸状态。取下三角瓶，转动内容物，用已知质量（m1）的玻璃坩埚式滤器或古氏坩埚减压抽滤。过滤时，先用倾泻法过滤，将酸性洗涤剂溶液滤干后，用玻棒将残渣搅散，加入90～100ºC的热水倾洗3～4次，减压抽滤，洗净酸液后将残渣转移入滤器中，重复水洗，认真冲洗滤器的内壁，至酸—洗涤剂洗尽为止。用丙酮同样洗涤滤器2、3次，直到滤出液无色为止。抽干滤渣中的丙酮，放入100ºC鼓风式干燥箱中干燥3h，冷却后称其质量（m2）。结果计算粗纤维（酸性洗涤纤维）％=（m2—m1）/m*100式中：m2：粗纤维和空坩埚质量，g；m1：空坩埚质量，g；m：烘干样品质量，g。5.3油料作物和谷类作物籽粒中油脂的测定脂类在植物细胞和组织中存在形态可分为两类，一类为游离态，另一类为结合态。游离态油脂常常大量聚积于植物的贮藏器官中，以小滴形状而存在。所以当细胞被破坏并施以压力，可以将个别小滴联成大滴，而聚集到充足的大滴时就得到了液体油。这就是榨油工业的基础。另一种类则是与其它成分相结合的脂类。例如，存在于谷物等淀粉颗粒中以及植物营养组织中结合态的脂类。种子的含油量因不同作物而不同，在同一作物的不同品种之间差异也很大，如大豆种子的含油量变动在10～25％，一般约在15～18％。磷肥对提高植物含油量有良好的作用。在农业利用上为了评价谷类和油料作物种子的品质时，常常要测定游离态油脂含量；在评价动、植物脂类品质时往往还需要鉴定其脂肪酸构成及其有关理化性质。测定作物种子中游离态袖脂的方法有油重法（直接法）和残余法（间接法）。乙醚提取—直接测定油重法，结果精准、稳定，广为国内外所采纳，我国国家标准中将油重法作为仲裁法，但此法所用仪器每次只能测定一个样品，不适合于大批样品的测定。间接测定残余法适合于大批样品的分析，分析效率较高，测定结果与油重法较为一致。在有精密折光仪的条件下，大批同种油料作物种子样品含油量的测定，采纳简单快速而精准的折光法，*为便利。油重法（索氏提取法）方法原理油脂不溶于水，但能溶于乙醚（沸点35℃）、石油醚（30～60℃）、二硫化碳（46.3℃）、丙酮（56.5℃）、四氯化碳（70℃）、三氯甲烷（61℃）、苯（80℃）等有机溶剂中，因此可以用这些溶剂将植物样品中油脂浸提出来，然后加热赶去溶剂即可求得油脂含量。常用的溶剂为无水乙醚及石油醚，因其有低沸点的优点，便于提取；但又有易着火爆炸等缺点，测定时务须严防着火爆炸。这些溶剂除提取出游离态脂肪外，也能提出“类脂肪”，如磷脂、**醇、色索、蜡以及脂肪酸等脂溶性物质，故称之为“粗脂肪”。操作步骤1.试样制备选取代表性种子（小粒种子≥25g，大粒种子≥30g）。小粒种子，如油菜、芝麻，大粒种子如大豆、花生仁等。将样品预先在80℃烘箱中干燥约2h。谷类、大豆等经粉碎后通过40目筛。带壳油料种子如花生果、蓖麻籽、向日葵籽等，取样量不得少于50g，通过剥壳，分别称重，计算出仁率。再用切片机或小刀片切成0.5mm以下薄片，籽仁粉碎至均匀粉状。芝麻、油菜子用粉碎机或研钵细心研碎，注意不要留有整粒。样品处理完毕，立刻混匀，装入磨口瓶中备用。2.测定称取经105℃烘干1h后粉碎试样2～5g（**至0.001g）两份，全部移入干燥滤纸筒内（如无滤纸筒时也可使用滤纸包），试样上面用脱脂棉塞住，以防试样漂流，然后移入浸提筒内。事先将干净的接受器烧瓶100～105℃烘箱内干燥0.5～1h，烘至恒重（m1），加入约占瓶体2／3体积的无水乙醚，把索氏提取器各部分连接起来，打开冷凝水流，在水浴上进行抽提。调整水浴温度（夏天约65℃，冬天约80℃，切忌明火，注意室内通风），使冷凝下滴的乙醚速度为120～180滴／min，使乙醚不断回流提取，一般浸提时间需8～10h。提取结束后，取下浸提筒，用镊子取出圆筒滤纸，连接好浸提筒，在水浴中加热蒸馏回收接受器烧瓶中的乙醚，用纱布擦净烧瓶外部，取下烧瓶，在沸水浴上蒸去残余的乙醚。将盛有脂肪的烧瓶放入105℃烘箱中，烘干1h，移入干燥器中冷却至室温后称重，**至0.001g。再烘30min，冷却，称重，直至恒重（m2）。结果计算粗脂肪，%（干基）（m2—m3）/（m2—m1）*100式中：m1：接受烧瓶的质量，g；m2：接受烧瓶和脂肪的质量，g；m3：样品的质量，g。带壳油料种子粗脂肪％=籽仁粗脂肪％／出仁率％平行测定的结果用算术平均值表示，保留小数后两位。平行测定结果的相对相差，大豆不得大于2％，油料作物种子不得大于1％。5.4有机酸和维生素分析有机酸广泛存在于植物体中，如在果蔬中重要含有苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸和草酸等。它们属于弱酸类，常以游离态及钾、钠、钙盐的形式存在于植物体内，其成分及含量与植物品种、培养条件及生长情形紧密相关。有机酸作为酸味成分，其适合的含量可加添果蔬的风味，但过量时又显示出**的品质。因此，测定果蔬的酸度及其与糖含量的比值，能判定果蔬的成熟度和品质；而且有机酸在食品的加工、贮存、品质管理、评价以及生物化学等领域，被认为是紧要的成分，常要对农产品中的总酸量、特定的有机酸进行定量测定，乃至分析全部有机酸的构成。有机酸量的多少、强弱常用酸度来表示。酸度的测定包括总酸度（可滴定酸度）、有效酸度（氢离子活度、pH值）和挥发性酸。总酸度是全部酸性成分的总量，通常用标准碱来测定并以样品中所含重要酸的百分数表示，但有的农产品由于缓冲作用和色素的影响，往往难以判定滴定尽头，在这种情况下，可以使用电位滴定法。但是人们味觉中的酸度，重要不取决于酸的总量，而是取决于离子状态的那一部分酸（游离酸），一般以氢离子活度（pH值）来表示，称为有效酸度。测定pH值的方法很多，其中以pH计较为精准、简便。至于各种有机酸的分别和定量，通常用柱层析法、纸层析法、气相色谱法和羧酸分析仪法。5.4.1总酸度的测定中和滴定法方法原理样品中的有机酸用碱滴定时，被中和生成盐类。用酚酞作指示剂，它在pH约8.2时达到尽头。*后以NaOH的毫摩尔数来计算有机酸的含量。操作步骤在小烧杯中称取捣碎均匀试样10～20g，用约150mL水将其移入250mL容量瓶中，充分摇匀后稀释定容。用干滤纸过滤，取滤液50mL，加入酚酞指示剂3～4滴，用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色1min内不褪色为尽头。结果计算酸度％=C*V*10—3*K*k/m*100式中：C：标准溶液NaOH的浓度，molL—1；V：NaOH标准溶液的用量，mL；K：换算为适当酸的系数，gmol—1：苹果酸67，柠檬酸64，含1分子水的柠檬酸70，乙酸60，酒石酸75，乳酸90；10—3：将mL换算成L的系数；k：分取倍数；m：样品的质量，g。注意事项1.本试验所用的蒸馏水应经煮沸除去二氧化碳。2.若颜色过深，可先加入等量蒸馏水稀释后再滴定，或改用电位或电导滴定法。5.4.2有效酸度（pH值）的测定（电位法）果蔬食品pH值的变动不仅取决于原材料品种和成熟度，而且取决于加工方法。其pH值与总酸度之间没有严格的比例关系，pH值的大小不仅仅取决于酸的数量和性质（种类），而且受其中的酸、果胶、某些盐类和蛋白质缓冲本领的影响。测定pH值的方法有pH试纸法、标准色管比色法和pH计测定法。其中以pH计法*精准，操作也简便。5.4.3水果、蔬菜中有机酸组分的测定高效液相色谱法有机酸是果、蔬的重要构成分之一、果、蔬中有机酸的种类和含量变化很大。这些变化决议于品种、成熟度、气候条件及其它因素，常用气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法来测定有机酸。方法原理试样经处理后，直接将试样液注入反相化学键合相色谱体系，用磷酸氢二铵溶液（5gL—1）为流动相，有机酸在两相中调配分别，依照其碳原子数由少到多的次序从色谱柱中洗脱下来。用紫外检测器（214nm）或示差折光检测器检测并与标准样品比较定量。操作步骤1.有机酸标准溶液的制备分别取适量有机酸单个标准样，如酒石酸、苹果酸、柠檬酸等于25mL容量瓶中，用氢氧化钠溶液溶解后定容，配制标准浓度系列。2.样品溶液的制备对于液体试样需经合适倍数稀释，用Sep—PAKC18净化柱处理，收集馏出液，经0.45mm微孔滤膜过滤后备用；对于固体或半固体试样，要将其捣碎，均质后，加入肯定量的氢氧化钠溶液提取。经离心分别或过滤后收集提取液，用Sep—PAKC18净化柱处理，收集馏出液，经0.45mm微孔滤膜过滤后备用。3.色谱条件：固定相：C18键合相；流动相：磷酸氢二铵溶液pH2.5；流速：2mlmin—1；进样量：10mL；检测器：紫外检测器，214nm，0.1AUFS。测定和计算1.将待测样10mL注入色谱仪，依据其峰高或峰面积设定有关*佳参数如*小峰面积；2.注入有机酸标准系列溶液10mL，进行色谱分析；3.以各标准溶液的保留时间定性；4.依据有机酸标准系列溶液各响应值（峰高或峰面积）作一响应值与浓度的标准曲线；5.分别注入待测样10mL，进行色谱分析；6.依据各待测样的响应值，在标准曲线上查出其相应的含量。若高效液相色谱仪配有微处理机，则不必配制系列标准溶液，只要选择与待测分析样品浓度相近的（±10％以内）标准溶液注入色谱仪，仍以保留时间定性，依据标准样品的响应值由计算机计算出校正因子，再由计算机用比例计算法作定量计算。5.4.4维生素的测定维生素广泛存在于各种生物体中，其种类繁多，化学结构与生理功能各异。因此无法依照结构或功能分类，按其溶解性可分为脂溶性（VA、VD、VE、VK）和水溶性（VB1、VB2、VB6、VB12、VP、VPP、VC）两大类。维生素是人体生命活动不可缺少的营养物质，它们一般在动物和人体内不能合成或合成数量少，充足不了动物和人体的需要，必需依靠从食物中摄取。在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发生特有的缺乏症状，如缺乏维生素A、B和C时，可分别引起夜盲症、**和坏血病等，严重时足以致命。某些维生素含量的高处与低处，是评价农产品品质的紧要指标之一、测定维生素是一项比较多而杂的工作。一般测定程序是：①用酸、碱或酶分解试样，使其中的维生素游离出来；②用溶剂进行提取；③分别子扰物质，对样液进行分别提纯；④用适当的方法进行定量等。测定维生素的方法有微生物学测定法、生物学测定法等；仪器分析的方法有分光光度法、荧光分析法、薄层层析法、高效液相色谱法等。选用方法时应依据试样的品种、类型、待测维生素的性质、含量以及干扰物质多少等因素来决议。维生素C又称抗坏血酸，其纯品为白色无臭结晶，熔点为190～192℃，溶于水或乙醇，不溶于油剂，在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件下较稳定。还原型（L—抗坏血酸）可被氧化为氧化型（L—脱氢抗坏血酸），但仍有肯定的生理作用，假如进一步水解则生成2，3—二酮古乐糖酸，便失去生理作用。通常所说的总抗坏血酸包括还原型、氧化型抗坏血酸和2，3—二酮古乐糖酸。测定维生素C含量的方法有2，6—二氯靛酚法、2，4—二硝基苯肼法、铅—硫化氢法、碘量法、荧光分光光度法。2，6—二氯靛酚法用于测定还原型Vc，其它方法多用于测定总Vc的含量。还原型维生素C的测定（2，6—二氯靛酚滴定法）方法原理还原型抗坏血酸的分子中有烯二醇结构存在，因此具有还原性，它能将蓝色染料2，6—二氯靛酚还原为无色的化合物，而Vc则被氧化为脱氢Vc。2，6．二氯靛酚具有酸碱指示及氧化还原指示的两种特性，在碱性介质中呈深蓝色，而在酸性介质中呈浅红色（变色范围pH4～5），其于氧化态时呈深蓝色（碱介质中）或浅红色（酸性介质），还原态时为无色。依据这个特性，用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液目的是保持反应时肯定的酸度，避开Vc在高pH时被空气氧化。由于此染料不能氧化待测液中非Vc的还原性物质，所以，对Vc有肯定的选择性。本法适用于测定一般水果、蔬菜样品的还原型Vc（不包括脱氢Vc）。如试样中含有Fe2+、Sn2+、Cu2+、SO32—、S2O32—、SO2等还原性杂质，则有干扰。操作步骤1.试样处理（1）新鲜果蔬试样称取鲜样50～100g，放入组织捣碎机的杯中，加入等重量的草酸浸提剂，快速捣碎1min，将试样打成浆状。