果胶酶应用基理及活性检验方法

果胶酶应用基理及活性检测方法-1-2316:57:21伴随大家对健康环境保护纺织品需求增加和各国政府对环境保护强制力度加大,在纺织印染行业中一个新型纺织助剂———生物酶制剂应用逐步发展起来。现在,一个基于果胶酶新型纺织生物助剂正在应用推广中,它关键用于棉、麻前处理工艺。因为纺织企业多数对果胶酶生物特征不甚了解,在工艺应用过程中缺乏对应检测手段,使其推广受到限制。酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量关键指标,所以,建立适适用于纺织行业果胶酶酶活检测方法,是十分迫切和必需。2果胶酶酶促作用机理果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质多个酶总称。我们测定酶活值通常是这一类复合酶协同作用综合结果。果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。解聚酶关键是经过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。果胶酯酶作用是使果胶分子中甲酯水解,最终形结果胶酸。果胶质关键是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成直链状聚合物。部分Ｄ-半乳糖醛酸上羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一个或多个碱部分或全部中和。果胶质在植物细胞组织中起着“粘合”作用,在棉纤维初生胞壁中,果胶质含量约占9%,而麻纤维则更高。经过果胶酶作用,将果胶质降解为小分子物质,从纤维中游离出来,可使和其粘合在一起其它杂质(如蜡质、蛋白质、灰份等)和纤维素根本分开,达成棉精炼或麻脱胶目标。对于纺织行业,需要是将果胶催化水解成可游离出纤维、小分子物质果胶酶活性(力),所以,关键测定解聚酶活力。解聚酶对果胶分子酶促催化作用表现为,每切断一个果胶分子α-1,4糖苷键,就会形成一个还原性醛基。经过测定这些还原性醛基生成量,即可判定解聚酶酶活力。3测定酶活力(性)基础原理酶作为一个生物催化剂,其酶活力值是和其催化效率及有效(即有生物活性)酶含量相关。酶活力是酶在单位时间内将底物转化为反应产物能力,以Ｕ(ｍｏｌ/时间)表示,底物即是酶催化反应物。通常,酶制剂活力是以Ｕ/ｇ酶制剂(或Ｕ/ｍＬ酶制剂)表示,把酶制剂量和活力联络在一起,称为“比活力”。在特定条件下,经过测定单位量某种酶制剂在单位时间内催化足够量底物生成反应产物量,即可测出此酶制剂比活力。依据酶促反应动力学米氏学说,从酶被底物饱和现象出发,根据“稳态平衡”假说设想,可推导出以下公式:产物生成速率=ｋ3[总酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)式中:[总酶]———酶总浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);[底物]———底物浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);

ｋ3———在酶促反应第二步,形成最终产物速率常数;ｋｍ———米氏常数(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是当酶反应速率达成最大反应速率二分之一时底物浓度。要估量[总酶],首先要固定全部可控制独立变量,如ｐＨ值、温度等。当[底物]>>Ｋｍ时,底物对反应速率影响可忽略(酶饱和),酶促反应达成最大反应速率Ｖｍａｘ,其结果是:产物生成速率=ｋ3[总酶]=Ｖｍａｘ=ＵＵ就成为总酶量一个测量。所以,能够经过测定Ｕ来反应酶制剂中有效酶蛋白含量。4果胶酶酶活测定方法概述和比较测定果胶酶酶活方法有很多,但基础上全部是利用酶促分解果胶产生粘度下降或生成还原性醛基来测定果胶酶酶活。这些方法概括起来关键有粘度降低法、滴定法和分光光度法3种。本文分别选择一个较经典测定方法加以介绍。4.1粘度降低法4.1.1原理果胶溶于水后形成粘稠状溶液,其粘度和溶解度和其聚合和酯化程度相关。能够利用果胶这种性质,测其酶活力。即在一定温度、酶浓度下和一定反应时间内,测定标准果胶溶液粘度降低率。4.1.2操作方法浴中保温10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,继续保温,在不一样时间分别测定反应混合液流出粘度计小球时间。对照试验采取经热处理已失活酶液。4.1.3计算粘度下降百分数可用下式表示:粘度下降(%)=100(Ｔｏ-Ｔ)/(Ｔｏ-Ｔα)(2)式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分别为反应混合液、对照混合液和缓冲液流出时间(ｓ)。酶溶液要预先稀释,使粘度降低范围在20%～80%。在此范围内,酶浓度对数和粘度降低率成正比。以酶作用时间为横坐标、粘度下降百分数为纵坐标做标准曲线,在图中查出粘度下降50%时对应酶作用时间(Ｔ1/2)。在上述条件下,引发粘度下降50%酶量为10个果胶酶活力单位,即酶活单位=10/(Ｔ1/2/3600)。4.2滴定法4.2.1原理果胶酶根本水解果胶,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可和碘(过量)反应。反应后剩下碘可用硫代硫酸钠溶液滴定,据此可得出酶解反应产生半乳糖醛酸量。以生成半乳糖醛酸量衡量果胶酶活力。4.2.2测定方法取1%果胶溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,调ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加热煮沸。冷却后,取5ｍＬ反应液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸钠溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,摇匀,加塞,于室温下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸钠滴定至淡黄色,加0.5%淀粉指示剂1ｍＬ,继续滴定至蓝色消失为止。统计所消耗硫代硫酸钠毫升数Ａ。空白试验用10ｍＬ果胶溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不经保温,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,统计消耗硫代硫酸钠毫升数Ｂ。4.2.3计算

在上述条件下,1ｈ酶促转化果胶、生成1ｍｇ当量游离半乳糖醛酸所需酶量定为一个酶活单位。每毫升酶液活力单位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)式中:Ｎ———硫代硫酸钠当量浓度;0.51———1ｍｇ当量硫代硫酸钠相当于0.51ｍｇ当量半乳糖醛酸;20———分解果胶反应液总体积数;5、2、5———分别表示反应中加入酶液毫升数、反应时间、滴定时所取反应液毫升数。4.3分光光度法4.3.1原理果胶酶分解果胶,产生带有还原性醛基还原糖(以半乳糖醛酸计),部分显色剂可和其发生显色反应。依据颜色深浅不一样,能够经过分光光度计测定果胶酶酶活值大小。本文以最常见ＤＮＳ比色法介绍此检测方法,其显色剂为3,5-二硝基水杨酸。4.3.2操作方法取0.5%果胶溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,摇匀。在50℃水浴中正确反应0.5ｈ,取出后,快速在沸水浴中加热5ｍｉｎ,冷却。取0.5ｍＬ反应液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ试剂试管,加4ｍＬ蒸馏水,摇匀,在沸水浴中加热5ｍｉｎ,快速冷却。用分光光度计在540ｎｍ处测其吸光度值。参比液配制:加热灭活5ｍｉｎ0.5ｍＬ稀释酶液和0.5ｍＬ0.5%果胶溶液充足混合。4.3.3计算采取标准曲线法,配制一系列已知浓度标准葡萄糖溶液,在540ｎｍ处测定吸光度(Ａ),以葡萄糖浓度(Ｃ)为横坐标、吸光度(Ａ)为纵光标作Ａ.Ｃ标准曲线(参见5.2节图2)。由标准曲线可得公式:Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)未知试液测定吸光度值Ａ后,可经过上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。在上述条件下,每小时内每毫升果胶酶酶促转化果胶生成1ｍｇ当量还原糖(以半乳糖醛酸计)所需酶量定义为一个酶活单位。即:果胶酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀释倍数×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180(5)式中:194/180———葡萄糖换算成半乳糖醛酸量;2———测定中稀酶液被0.5%果胶溶液稀释倍数。4.43种方法比较将粘度降低法用来测定果胶酶复合酶活力比较正确,但操作过程也相对复杂,且测定灵敏度不高。滴定法设备使用简单,测试重现行好,正确度高,但测定时间长,过程较繁琐,试剂用量较大。而分光光度法测定灵敏度、正确度均高,重现性好,试剂用量少,尤其是操作省时、简便。对于上述3种测定方法,依据纺织行业特点,笔者认为分光光度法更适于纺织工作者应用。下面关键探讨ＤＮＳ比色法在实际应用中部分具体问题。5应用ＤＮＳ比色法测定果胶酶酶活

5.1果胶溶液配制和酶液稀释果胶溶液配制浓度和酶液稀释倍数是相互联络两个数据,它们确实定对酶活测定结果正确性起着关键作用。经过完成以下试验,能够确定相关参数条件。5.1.1材料和方法5.1.1.1仪器和试剂ＵＶ—9200分光光度计;果胶(Ｓｉｇｍａ)、果胶酶制剂(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水杨酸、巴比妥酸、巴比妥钠。5.1.1.2溶液配制ＤＮＳ试剂:将6.3ｇ3,5-二硝基水杨酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸钠热水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亚硫酸钠,待溶解、冷却后,加蒸馏水定容至1000ｍＬ,贮于棕色瓶中,一周后即可使用。5.1.1.3配制巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)称取1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥钠,加蒸馏水定容至1000ｍＬ。5.1.1.4配制0.5%果胶溶液正确称取0.5ｇ果胶于烧杯中,用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)溶解、稀释定容至100ｍＬ。5.1.2制作果胶酶稀释倍数和吸光度关系曲线分别按表1稀释倍数用蒸馏水稀释果胶酶,将稀释酶液按4.3.2测定吸光度值,以果胶酶稀释倍数倒数为横坐标,吸光度(Ａ)为纵坐标作关系曲线(见图1)。5.1.3结果和讨论由公式(4)、(5)可得出,在酶活相同情况下,吸光度和酶液稀释倍数倒数应呈正百分比关系。图1为试验测得果胶酶稀释倍数倒数和其酶活力吸光度值关系曲线,从中可看出果胶酶稀释倍数过低或过高全部会偏离正比线性关系,尤其在稀释倍数过低情况下。原因可能有以下两点:①依据米氏学说,底物浓度应保持足够大到使酶饱和,达成最大反应速率,酶活值和酶浓度才能成正比。过高酶液浓度可能使底物浓度相对不足,而不能满足这种正比关系。②依据朗伯-比耳定律,吸光度和浓度间只在一定范围内有很好正比关系,酶促反应产生高浓度产物和ＤＮＳ络合物颜色过深,会超出这一范围产生较大误差。稀释倍数过高时吸光度值也偏离朗伯-比耳定律,但仍满足底物使酶饱和条件,所以产生偏差相对小得多。果胶溶液配制一定要有足够大量,但过大果胶浓度又会使溶液粘度加大,增加操作误差。经过反复试验,在反应30ｍｉｎ条件下确定0.5%果胶浓度,效果最好。将表1最高稀释倍数和最低稀释倍数吸光度值删除,对其它数据进行回归分析,得到曲线回归方程为:Ａ=820.72Ｃ(Ｒ2=0.9943)。表明其线性相关度很好,说明当酶制剂稀释液吸光度值在0.2～0.4范围内时,其酶活值有很高正确度。用自产粗酶液进行了一样试验,也得到相同结果(见表2)。

所以,能够确定果胶溶液浓度为0.5%,控制酶液稀释倍数使吸光度值在0.2～0.4范围内。5.2葡萄糖标准曲线绘制绘制葡萄糖标准曲线目标,也是找到葡萄糖溶液浓度和吸光度最好线性关系范围。绘制参考数据及结果见表3、图2。由图2可见,在此范围内,曲线有很好线性关系。本测定方法采取葡萄糖绘制标准曲线,因为葡萄糖易得,且价钱廉价。用还原糖作为标准曲线,是为了标定果胶分解产生还原性醛基量。在公式(5)求酶活公式中,有一项葡萄糖和半乳糖醛酸转换系数,可换算为以半乳糖醛酸计。所以,不管用哪种还原糖作标准曲线,结果全部是相同。5.3试验温度和ｐＨ范围酶促反应全部有最好反应温度和ｐＨ范围。在最好酶反应范围内,酶作用活力最高。最好酶反应ｐＨ值和温度范围是由酶本身性质、特点所决定,过多偏离此范围会使酶活性降低甚至失去活性。所以在测定果胶酶活性时,作用温度和ｐＨ值要和其最好反应条件范围相一致。最好酶反应条件通常会由酶制剂厂家提供。在纺织领域应用果胶酶,通常以碱性果胶酶为主。本试验应用就是碱性果胶酶,其最好反应条件是温度45～55℃,ｐＨ范围8～9。配制果胶酶溶液用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6),在50℃水浴中进行酶促反应可取得最好试验结果。5.4降低试验误