实验动物质量控制

医学实验动物学实验动物质量控制 微生物的标准化

实验动物微生物质量控制的目的，是要求生产的实验动物达到预定的微生物质量标准，而且动物实验过程也要执行同样的微生物质量标准。东北农业大学28名师生感染布鲁氏菌病2010年12月19日下午，“羊活体解剖学实验”；2011年1月，王永杰连续高烧很多天了。由于是冬天，感冒发烧也属正常，所以他没有警觉。经过吃药、打针等治疗后，他终于有些好转，却总觉得不是那么舒服。2011年3月开学，发现症状一样的同学有好几个。“开学时，一位姓王的同学被其母亲背到了学校，他因为关节疼痛已无法行走。”最终查出，共5个班级28人被感染布鲁氏菌病，其中包括27名学生、1名老师。“布鲁氏菌病还属于《职业病范围和职业病患者处理办法》规定的乙类职业病。我们查过法律法规，许多行业对布鲁氏菌病患者都有着严格的限制。原因：1、使用未经检疫的动物；2、未切实按照标准的实验规范执行。一、实验动物微生物质量控制的原因引起实验动物的疾病和死亡干扰实验结果如：仙台病毒感染 B、T淋巴细胞对抗原反应减弱，增加干扰素产量，减少血清第三补体因子（C3）水平；小鼠肝炎病毒感染 网状内皮系统的吞噬细胞活性、淋巴细胞的细胞毒活性被抑制，诱导血清天冬氨酸转氨酶AST、丙氨酸转氨酶ALT等肝酶 。人兽共患病既能感染动物、也能感染人类引起疾病影响生物制品的质量二、污染源和传播途径1、实验动物2、材料和设备3、宠物4、工作人员人是两组动物间传播污染源最重要的因素。人能成为在接触被污染动物后的媒介和病原微生物的临时宿主。1、普通动物2、清洁动物3、无特定病原体动物4、悉生动物5、无菌动物三、按微生物学控制的动物分类普通级动物

conventionalanimal,CV定义：不携带规定的人兽共患疾病原和动物烈性传染病病原的实验动物。常用普通级动物：豚鼠、地鼠、兔、犬、猪、猴清洁级动物

clean

animal,CL定义：除普通级动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原的实验动物。根据我国国情自行设定的等级动物。必须来源于SPF动物或无菌动物，饲养在半屏障系统中。一般针对小动物而言，如大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠、兔等。无特定病原体级动物,SPFspecificpathogenfree

animal定义：除清洁级动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验动物。标准的实验动物必须来源无菌动物或悉生动物常用SPF级动物：大鼠、小鼠无菌级动物

germ

free

animal,GF定义：无可检出的一切生命体的实验动物。同属四级动物的还有：悉生动物，将无菌动物体内植入已知微生物的实验动物；根据植入的菌种数，可将其分为单菌、双菌、三菌和多菌动物。通过子宫切术术、剖腹产术、胚胎移植等方式获得。但偶尔会发现有微生物存在，为经过胎盘传播或通过其他途径（垂直感染）在妊娠中传给子代。原籍菌群丢失，表现出多样的形态学和生理学“异常”。如盲肠明显增大，肠壁更薄弱。健康动物处死浸在37℃灭菌液中送进无菌隔离器剖腹手术切除子宫将子宫浸消毒液即送到另一只隔离器中切开子宫取胎用灭菌纱布揩拭仔体并电刀断脐放入隔离器内人工喂乳或保姆代养国际分级法等级种类饲养条件控制程度备注三级无菌动物Germfree

animal隔离系统Isolationsystem以封闭的无菌技术获得,用现有方法不能检出任何微生物和寄生虫的动物。三级悉生动物Gnotobioticsanimal隔离系统Isolationsystem确知已带的微生物，经无菌条件饲养的动物。明确所带的微生物。二级无特定病原体动物Specific

pathogenfree

animal屏障系统Barriersystem不带有指定的致病性微生物和寄生虫的动物。带有非特定的微生物和寄生虫一级普通动物Conventionalanimal开放系统Open

system不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病的病原。对微生物携带状况不明确等级种类饲养条件四级无菌动物Germfreeanimal

GF隔离系统Isolation

system四级悉生动物Gnotobioticsanimal

GN隔离系统Isolation

system三级无特定病原体动物SpecificpathogenfreeanimalSPF屏障系统Barrier

system二级清洁动物Cleananimal

CL屏障系统Barrier

system一级普通动物Conventionalanimal

CV开放系统Opensystem国家标准分级洁净度

（

cleanliness

）：洁净环境内单位体积空气中含大于或等于某一粒径的悬浮粒子的允许统计数空气洁净度等级(N)大于或等于表中粒径的最大浓度限值(pc/m3)0.5μm1μm5μm12433584（十级）352835（百级）3520832296（千级）3520083202937（万级）3520008320029308（十万级）3520000832000293009（百万级）352000008320000293000国家标准GB50073-2001实验动物微生物等级与饲养设施要求隔离器屏障系统四、主要动物特点及应用1、清洁动物与SPF动物的应用CL动物国际上认为仅适合短期或部分科研实验；我国认为适用于大多数科研实验，可用于生物医学研究的各领域。SPF动物适用于所有科研实验，是目前国际标准级别的实验动物。2、无菌动物的特点形态学改变消化系统:

盲肠膨大，易发生盲肠扭转，导致破裂。循环系统：心脏变小。免疫系统：胸腺上皮细胞变大，胞浆泡状结构和溶酶体变小。生理学改变免疫功能：免疫应答慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。对微生物感染非常敏感。生长率：豚鼠、兔生长率降低，大、小鼠改变不大。代谢：水分代谢周期延长，肠管对水的吸收率低。营养：体内不能合成VitB、VitK。抗辐射能力：增强。寿命：长于普通动物。3、悉生生物学(gnotobiology)：1885年pasteur认为宿主动物没有肠道菌群参与，生命难以维持。无菌动物的问世，证明肠道菌群的存在，并非完全是哺乳动物生存所必需。悉生生物学是以无菌隔离技术提供的各种动物为实验对象，研究实验动物本身以及各种动物与微生物之间相互依存和制约关系的一门综合科学。4、无菌动物的应用微生物研究GF是研究微生物与宿主相互作用，即微生生物与宏生生物相互关系，微生物与微生物的共生与拮抗关系的最佳动物；口服霍乱弧菌使幼龄GF豚鼠死亡，口服前感染梭状芽胞杆菌，动物不发生死亡；口服福氏痢疾杆菌使幼龄GF豚鼠死亡，口服前接种大肠杆菌，动物不发生死亡；炎症涉及细菌感染的多因素作用，GF可把多因素变成单因素，整体反应变成局部反应。老年学研究GF大鼠寿命比CV大鼠延长1/3；雌性GF寿命比雄性动物短，雌性CV动物比雄性长；2-3年的GF大鼠脏器均未呈现同龄CV大鼠所具有的各种衰老变化肿瘤学研究在致癌因素中，微生物引起癌变的比重较大。GF大鼠比CV大鼠易发生激素依赖性肿瘤。GF动物口服苏铁素不出现肿瘤，但CV动物口服苏铁素出现肿瘤。五、实验动物常见感染性疾病★

重要的人兽共患病★

主要的烈性传染病★

常见的微生物和寄生虫感染1、重要的人兽共患病流行性出血热弓形虫病淋巴细胞脉络从脑膜炎沙门菌病狂犬病猴B病毒感染猴结核病疾病病原媒介动物人类临床症状传染途径猴疱疹病毒感染(B-Virusinfection)cercopithecineHerpesvirusType

1猕猴类肌痛、发热、头痛；迅速发展的上行性麻痹；感觉异常、复视、运动失调、潴尿、抽搐、吞咽困难，直至死亡唾液(咬伤)、抓伤出血热(Koreanhemorrhagic

fever)HantaanVirus大鼠、小鼠肌痛、咳嗽，发热、腹泻、出血、蛋白尿、肾脏损害，严重致死吸入感染、啮齿类动物咬伤、伤口污染淋巴细胞脉络丛

脑膜炎病毒感染症(LCM)小鼠、仓鼠肌痛、发热、恶心、呕吐、喉痛、畏光。类似流行性感冒的症状，头痛、接触感染(接触小鼠粪便和尿液)；吸入；咬伤，或由节肢动物如蚊子、蟑螂传播狂犬病(Rabies)Lyphocyticchoriomeningitis virusRhabdovirus所有哺乳类头痛、肌痛、发热、恐水、狂妄、抽搐、昏厥、死亡咬伤、皮肤伤口或黏膜感染含狂犬病毒的唾液结核病(Tuberculosis)Mycobacterium tu-berculosis犬、猫、猴咳嗽、生痰、咳血、体重减轻、吸入传染，或经口腔、无力疲倦、发热、发冷、恶病 伤口及消化道感染质弓形虫病toxoplasmosis狗、鼠等猫、猪、羊、导致自然流产、死胎、早产和新生儿严重感染

，后天：局限性感染以淋巴结炎最为多见

；全身性感染多见于免疫缺损者（爱滋病、恶性肿瘤）①先天性弓形虫病系通过胎盘传染

，②后天获得性弓形虫病主要经口感染沙 门 氏 菌 病(Salmonellosis)Salmonellatyphimu-riumS．

enteritidis鼠类、犬、猫、灵长类急性肠胃炎，腹痛、腹泻、恶心、发热、厌食经由食物、饮水感染疾病病原症状传播方式控制小鼠脱脚病

(ectromelia)Mousepoxvirus小

鼠脱脚病毒脚、尾、鼻出现皮疹和溃疡，严重出现尾坏死脱落。急性发作可引起大批小鼠死亡。皮肤伤口、呼吸道消化道兔出血

症Rabbithemorrhagic

diseaseRabbithemorrhagicdiseasevirus病兔精神沉郁，食欲不振或废绝，饮欲增加，被毛零乱、无光泽，兔耳耷拉。幼兔多呈急性型，通常看不到临床症状，突然死亡。病兔的排泄物及污染物等，空气传播是主要传播方式。2、主要的烈性传染病鼠痘兔出血症（兔瘟）3、常见的微生物和寄生虫感染鼠肝炎病毒感染仙台病毒感染鼠肺支原体病嗜肺巴斯德杆菌病小鼠呼肠孤3型病毒感染球虫病犬细小病毒感染犬瘟热六、实验动物的微生物学和寄生虫学质量监测1、监测的意义实施微生物学与寄生虫学监测，是保证实验动物质量及标准化的必要手段。通过监测可掌握动物群中病毒、细菌、寄生虫的流行情况，及时诊断感染性疾病，发现并控制其传播，以保证实验动物的健康。2、监测的内容不同级别实验动物的微生物和寄生虫监测内容不同。国家技术监督局制定了标准(GBl4922.1—2011和GBl4922.2—2011)

。3、检验方法目前国标推荐使用的方法学和详细检验程序。病原菌以分离培养鉴定为主，病毒以检测抗体为主，寄生虫以镜检为主。七、实验动物的微生物和寄生虫控制国家标准不同等级啮齿类、兔、犬和猴等实验动物要求排除的细菌、病毒应根据国家技术监督局制定的有关实验动物微生物学等级及监测标准(GB14922.2—2011)。有关实验动物寄生虫学等级及监测标准是(GB14922.1—2011)

。大小鼠—清洁级、SPF级、无菌级豚鼠、地鼠、兔–

普通级、清洁级、SPF级、无菌级犬、猴—普通、SPF群体规模取样数量<100>5100—500>10500>20每一隔离器2只1、取样原则：

随机抽样

依群体大小取样：

检查抗体选择成年淘汰动物，而病原体选幼年动物2、检测时间与频率：3、检测步骤动物编号外观检查麻醉（体外寄生虫检查）

皮肤取样（真菌的检查）取血（血清检查病毒或其它病原微生物抗体）无菌解剖（脏器、肠内容物、粪便、体内寄生虫检查）（气管分泌物、肠内容物、脏器分离细菌）检测检测报告检测项目的分类国标对必须检测和必要时检测作了限定性说明：“必须检测项目：是指在进行实验动物质量评价时必须检测的项目。必要时检测项目：是指从国外引进实验动物时、怀疑有本病流行时、申请实验动物生产许可证和实验动物质量合格证时必须检测的项目”。监测方法：1.

实验动物病毒检测：血清学诊断：血凝抑制试验（HI）；酶联免疫吸附试验（ELISA）。病原学检查：接种细胞培养物观察CPE出现（鼠痘、鼠肝炎）；血吸附试验（仙台病毒）；免疫酶试验（LCM病毒）。连续三次传代未有病毒迹象为阴性。接种敏感动物，观察发病、抗体产生、病理改变、接种动物病毒再分离。动物组织细胞传代培养。3）病毒颗粒、抗原和核酸的检出光镜检查病理改变或包涵体的存在；电镜检查组织内或排泄物中的病毒颗粒；