(高清版)GBT 41212-2021 纳米技术 荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧

纳米技术荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧Nanotechnologies—5-(and6)-Chloromethyl-2',7'Dichloro-dihydr国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I本文件使用翻译法等同采用ISO/TS19006:2016《纳米技术荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱——GB/T16886.5—2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验(ISO10993-5:Ⅱ多技术，但目前仅开展了CM-H₂DCF-DA法评价RAW264.7小鼠巨噬细胞ROS产生的比对研究。在有对照组的情况下，CM-H₂DCF-DA法也可能出现误判。有若干因素可能会造成假阴性0。CM-H₂DCF-DA法并非对所有的ROS都能实现最佳检测。例如，对半衰期较短的超氧阴离子和羟基分不同的ROS。其他检测方法对结果进行进一步确认(参见附件A替代细胞系)。当检测体系中存在着可能会造成假ⅢGB/T41212—2021/IS1ISO10993-5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验(Biologicalevaluationofmedicaldevices—Part5:TestsforinvitrocytoISO/TS80004-2纳米技术术语第2部分：纳米物体(Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:2GB/T41212—2021/ISO/TS1颗粒particle3GB/T41212—2021/ISchloro-dihydro-fluoresDMEM:Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium)MESF:可溶性荧光基团(molecularequivalentylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetraPBS:磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline)ROS:活性氧(reactiveoxygenspe-80℃或以下。长期冻存(几个月到几年)则需要在-130℃或以下。用MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性时，应遵循细胞培养技术的基本原则中关于冻存细胞扩增的4GB/T41212—2021/IS纯度。5.3.9无酚红DMEM。6.224孔培养板。6.4离心机。5a)抗团聚的稳定性(反映在平均颗粒尺寸上);b)胶体悬浮液的稳定性(反映在沉淀和沉降程度上)。害标准)中进行。纳米颗粒的ROS检测实验流程参见图1。图1纳米颗粒的ROS检测实验流程6GB/T41212—2021/ISO/TS1背景荧光。仪器设置应遵照制造商的要求。通过测量参照物的荧光来建立相对强度校准曲线mg/mL两性霉素B。应采用规范的细胞培养操作7。将细胞悬浮在无酚红的培养基(10%FBS)中，密度达2×10⁵细胞/mL。率。细胞活力宜保持>95%(通过台酚蓝染色实验判定),培养时间在48h以内。a)在24孔板中分别培养细胞24h和48h:1)每孔接种500μL(200000细胞/mL),每个实验组设置8个重复样品；2)每个时间段(24h和48h)使用一个培养板；3)将培养板平稳地转移到培养箱中，避免干扰细胞贴壁导致细胞分布不均匀；5)在每个时间点(24h和48h),从培养箱中取出一块培养板；6)用体视显微镜记录细胞的状态和形貌，如图2所示。7GB/T41212—2021/ISO/TS1)轻吸除去孔中的培养液；3)将含有细胞的培养基加入离心管中；4)在离心机中，将细胞悬液以400×g、5min离心形成沉淀；5)弃去上清液；6)在100μL培养基中，加入25μL含0.4%台酚蓝的PBS溶液；7)用移液器吹打细胞沉淀，重悬在台酚蓝/培养基溶液中；8)将细胞悬液滴在细胞计数器上；9)用体视显微镜对细胞计数器中的细胞进行计数，记录活细胞和死细胞(蓝色)的总数以及10)细胞增殖时间宜符合该细胞系预期的增殖时间。在纳米颗粒暴露实验前，细胞培养4的细胞活力宜>95%。8.8.2用含1.5pg/mLCM-H₂DCF-DA/PBS溶液将纳米颗粒悬浮液稀释至1μg/mL、10pg/mL、8.8.6检测纳米颗粒是否发光或纳米颗粒与CM8.8.8如果纳米颗粒悬浮液干扰CM-H₂DCF-DA测定，则不用此方法测定纳米颗粒引发的细胞8GB/T41212—2021/ISO/TS1电中性和带负电荷的聚苯乙烯可能不具在-20℃下，1m将带有正电荷和负电荷的聚苯乙烯悬浮液浓度调至10mg/mL。9.1准备24孔板中的细胞9.1.3在37℃,潮湿的5%CO₂培养箱中孵育细胞24h。9.2.3用移液器转移500μL体积的纳米颗粒悬浮液、9GB/T41212—2021/ISO/T苯乙烯(+PS)苯乙烯(-PS)不处理(NT)测试NTNoDCFNTNoDCFNTNoDCF图324孔板纳米颗粒和对照物用量9.3CM-H₂DCF-DA细胞暴露9.4用CM-H₂DCF-DA孵育细胞9.4.2先用移液器除去非牢固贴壁的细胞、PBS和DCF;然后，使用无血清培养基(不含酚红的细胞仪分析应尽快进行(在1h内),单次实验不要超过20个～30个样品。GB/T41212—2021/IS9.5.2在流式细胞仪上分析CM-H₂DCF-DA染色的细胞(收集10000个细胞)。a)确定包括对照组在内的所有样品的平均荧光强度(MFb)准备一个电子表格，将纳米颗粒处理组细c)根据8.8和9.5.2收集的数据，确定纳米颗GB/T41212—2021/ISO/TS1细胞数细胞数GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016(资料性)通过采用8.7的标准操作规程验证RAW264.7细胞的健康状况和生长速率。纳米颗粒在RAW264.7细胞中产生活性氧的能力使用第9章和第10章的标准操作规程进行评价。对细胞健康状况进行评估的两个重要指标是生长率和实验时间内细胞活力。IANH召集的六家实验室发现细胞经过48h实验具有大于90%的细胞活力，如图D.2所示。增加计数细胞数量和用于评123生长时间细胞活力/%细胞活力/%图D.2RAW264.7细胞在24h和48h的细胞活力D.4暴露于纳米颗粒的RAW264.7细胞中的ROS产生(图D.3)将RAW264.7细胞暴露于带正电的聚苯乙烯(60nm)和二氧化铈(约200nm)24h,然后暴露于CM-H₂DCF-DA。暴露于带正电荷的聚苯乙烯的细胞荧光强度随暴露剂量增加显著增强，而暴露于二氧化铈颗粒的细胞荧光强度在不同暴露剂量保持不变。暴露剂量/(ug/mL)相对平均荧光变化作为示例，图D.3仅给出了其中一家实验室的测量结果。与未暴露的细胞相比，两种材料都导致了平均荧光强度的增加，但暴露于带正电荷的聚苯乙烯导致平均荧光强度随暴露剂量增加而显著增强，而暴露于二氧化铈则无明显剂量关系。[2]ISO29701:2010Nanotechnologies—Endotoxintestonnanomatesystems—Limulusamebocyte[3]ISO/TR13097:2013Guideliuringreactiveoxygenspecies(R[5]ISO/TS80004-2:2015Nanotechnologies—Vocabul[6]BIHARIP.,VIPPOLAM.,SCHREICHELC.A.OptimizeddispersionofnanopFibreToxicol.2008,5p.14.[7]COECKES.,BALLSM.,BOWEG.,DAVISCulturePractice,ATLA,33,pp.261-287,2005;Freshney,R.I.(1993)CultureofAnimalManualofBasicTechnique,3rded.,NewYork:Wiley-LiUSA:2010.[9]KALYANARAMANB.,DARLEY-USMARV.,DAVIESK.J.,DENNERYP.A.FORMAH.J.,GRISHAM,M.B.,MANN,K.MOORE,G.E.,ROBERTSⅡ,L.J.,ANDISCHIROPOULOS,H.MeasuringreactiveoxygenFreeRadic.Biol.Med.2012,52pp.1-6.[10]KROLLA.,PILLUKATM.H.,HAHND.,SCmethodsinnanoparticleriskassessment:Limitatiop.370.[11]ProtocolforNanoparticle/public[12]PreparationofNanoparticleDispersionsfromPowdtion.NISTSpecialPublication1200-2availableunder:/cations/NIST.SP.1200-2.pdf.[13]PORTERD.,SRIRAMK.,WOLFARTHM.,JEFFD.,ANDREWM.Abiocompatiblemediumfornanoparticledis[14]RAMIREZ-GARCIAS.,CHENL.,MORRISM.A.,DAWSONK.A.Anewforstudyingnanoparticleinterusingchemicalstabilisers.Nanoscale2011,3pp.4617-4624.[15]ROESSLEINM.,HIRSCHC.,KAISERJ.-P.,KRUGH.F.,WICKP.ComparabilityExample.Int.J.Mol.Sci.2013,14pp.24320-24337.[16]STROBERW.2001).‘MonitoringceH.,SherachE.M.,StroberW.CurrentProtocolsinImmunologypersionoftitaniumdioxidenanoparticlesinbiologicalmedia.Nanotoxicology.2013,7pp.389-401.[18]WANGL.,GAIGALASA.K.,MARTIG.,tativefluorescencemeasurementswithmulticolorflowcytometry.Cytomet[19]WANGL.,&GAIGALASA.K