2025届高考生物一轮总复习学生用书选择性必修3第十单元生物技术与工程第51讲基因工程的基本工具和基本操作程序考点一重组DNA技术的基本工具

第51讲基因工程的基本工具和基本操作程序【课标要求】1.阐明重组DNA技术的实现须要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获得、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.活动：（1）DNA的粗提取与鉴定。（2）DNA片段的扩增及电泳鉴定。考点一重组DNA技术的基本工具1.基因工程的概念2.重组DNA技术的基本工具（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）。①主要来源：。②种类：分别的限制酶有种。③特点（专一性）：识别双链DNA分子的。使每一条链中特定部位的断开。④[易错提示]限制酶作用的化学键是磷酸二酯键，不是氢键；在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割2次此DNA分子，产生4个末端。（2）DNA连接酶。（3）载体。[易错提示]与膜载体的区分：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。[答案自填]1.DNA分子转基因遗传特性生物类型基因重组2.（1）①原核生物②数千③特定核苷酸序列磷酸二酯键（2）磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端和平末端（3）环状双链DNA分子噬菌体、动植物病毒一个至多个自我复制受体DNA标记[教材命题点思索]1.自然的DNA分子是否可以干脆用作基因工程载体？为什么？提示：不行以。含有复制原点、含有一种或多种限制酶的识别序列、有标记基因等特点的DNA分子才可以干脆用作基因工程的载体。事实上，自然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往须要进行人工改造后才能用于基因工程操作。2.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备一般质粒载体的条件外，还应具有的条件是______________________________（答出2点即可）。提示：对靶细胞具有较高的转化效率、不能增殖、对细胞无害3.限制酶EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。提示：—GAATTC……GAATTC——CTTAAG……CTTAAG—目的基因1.限制酶的选择原则（1）依据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。③为避开目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可运用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因）。（2）依据质粒的特点确定限制酶的种类。（3）依据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取（设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ）。2.标记基因的作用可用于检测目的基因是否导入受体细胞。1.（2024·高考新课标卷）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（）A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接B．质粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接解析：选C。只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或使目的基因在质粒中反向连接，A项不符合题意；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B项不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可运用T4DNA连接酶连接，使目的基因定向插入质粒中，C项符合题意；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D项不符合题意。2.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（TetR）和氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。请回答下列问题：（1）EcoRⅤ酶切位点为，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为末端。（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在酶作用下，形成重组质粒P3。（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，接受含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长状况见下表（“＋”代表生长，“－”代表不生长）。依据表中结果推断，应选择的菌落是（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入状况分别是、。平板类型菌落类型ABC无抗生素＋＋＋氨苄青霉素＋＋－四环素＋－－氨苄青霉素＋四环素＋－－（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，缘由是___________________________________________________。解析：（1）由题图可知，EcoRⅤ酶切出来的载体质粒为平末端。（2）由题图可知，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应当各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。（3）由题图可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培育基中存活，故应当选B类菌落。A类菌落能在题表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培育基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。（4）据题图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物。假如用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，假如用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确（反向插入）时，乙、丙两引物都结