人教版教学教案生物专题五DNA蛋白质技术新课标选修一

专题5DNA和蛋白质技术【课题目的】本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。【课题重点与难点】课题重点：DNA的粗提取和鉴定方法。课题难点：DNA的粗提取和鉴定方法。【知识要点】DNA的物理化学性质，特别是DNA的溶解性；2.二苯胺法鉴定DNA的方法和原理。[学习导航]DNA和蛋白质技术，涉及DNA的提取、蛋白质的提取、DNA片段的扩增等，是开展分子生物学研究的基本技术。本专题将从基础入手，学习DNA的粗提取、PCR技术和血红蛋白的提纯。学习这些技术，不仅可以帮助学生初步了解分子生物学的基本实验方法，并且可以巩固必修课中学习的有关DNA和蛋白质的理论知识。本专题的3个课题相对独立，没有严格的先后顺序。课题1的操作难度不高，学生比较容易获得结果。课题2的操作难度也不高，但PCR技术的原理是难点，学生要充足运用教材的图文资料，并且在教师的引导下进行实验操作。课题3的操作难度比较大，所以学生一定要在教师的精心指导下完毕操作。课题1DNA的粗提取与鉴定[导学诱思]1．提取DNA的方法提取生物大分子的基本思绪是。对于DNA的粗提取而言，就是要运用、等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的中溶解度不同，运用这一特点，选择适当的盐浓度就能使充足溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达成分离目的。图5—1是DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，请根据曲线图，思考：①在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？此外，DNA不溶于溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。运用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解，但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在以上才会变性。洗涤剂可以崩溃，但对DNA没有影响。3）DNA的鉴定在条件下，DNA遇会被染成色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。2．实验设计1）实验材料的选取凡是具有的生物材料都可以考虑，但是使用的生物组织，成功的也许性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料：鱼卵、猪肝、菜花（花椰菜）、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌思考：哺乳动物的红细胞的特点？2）破碎细胞，获取含DNA的滤液动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的，同时用搅拌，过滤后收集滤液即可。假如实验材料是植物细胞，需要先用溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的和，进行充足的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。思考：①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？③假如研磨不充足，会对实验结果产生如何的影响?④此环节获得的滤液中也许具有哪些细胞成分？3）去除滤液中的杂质阅读课本的三个方案，思考：为什么反复地溶解与析出DNA，可以去除杂质？方案二与方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出与鉴定将解决后的溶液过滤，加入与滤液体积、冷却的，静置，溶液中会出现，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的。混合均匀后，将试管置于中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变。3．操作提醒以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g，防止。加入洗涤剂后，动作要、，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续环节地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要，以免，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。二苯胺试剂要，否则会影响鉴定的效果。4．结果分析与评价[疑难点拨]DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度减少；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入柠檬酸钠的因素制备鸡血细胞液时，要在新鲜的鸡血中加入抗凝剂——柠檬酸钠，防止血液凝固。其原理是柠檬酸钠能与血浆中Ca2+发生反映，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液便不会凝固，由于鸡血红细胞，白细胞都有细胞核，DNA重要存在于细胞核中，所以在离心或静置沉淀后，要弃出上层清液——血浆。3．提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而导致检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽也许使细胞内的DNA所有溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。4．在DNA的析出的环节中用到玻璃棒搅拌时，注意动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。5．盛放鸡血细胞液的容器，最佳是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最佳使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。[典例解析]本实验中有三次过滤：⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液以上三次过滤分别为了获得（）A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNAD含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液答案：A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须通过实验中其他环节得相继解决，方能得到较纯的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可通过滤留在纱布上。【课本问题答案和提醒】（一）旁栏思考题1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有助于DNA的释放；食盐的重要成分是NaCl，有助于DNA的溶解。3．假如研磨不充足，会对实验结果产生如何的影响？答：研磨不充足会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4．此环节获得的滤液中也许具有哪些细胞成分？答：也许具有核蛋白、多糖和RNA等杂质。5．为什么反复地溶解与析出DNA，可以去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就可以除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6．方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是运用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三运用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。（二）练习1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而导致检测的困难；第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽也许使细胞内的DNA所有溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是由于，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。[课堂演练]一、选择题（10个）1.在研究DNA的基因样本前，采集来的血样需要蛋白水解酶解决，然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶解决血样的目的是（D）A.除去血浆中的蛋白质B.除去染色体上的蛋白质C.除去血细胞表面的蛋白质D.除去血细胞中的所有的蛋白质，使DNA释放，便于进一步提纯2．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不对的的是（C）A.操作时缓缓滴加蒸馏水，减少DNA的溶解度B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整C.加蒸馏水可同时减少DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出D.当丝状粘稠物不再增长时，此时NaCl的浓度相称于0.14mol/L3．洗涤剂可以崩溃（B），但对DNA没有影响。A.细胞壁B.细胞膜C.细胞核D.细胞质4．在沸水浴的条件下，DNA遇（D）会被染成蓝色。A.斐林试剂B.苏丹Ⅲ染液C.双缩脲试剂D.二苯胺5．在DNA提取过程中，最佳使用塑料试管和烧杯，目的是（B）A.不易破碎B.减少提取过程中DNA的损失C.增长DNA的含量D.容易洗刷6．下列操作中，对DNA的提取量影响最小的是（B）A.使鸡血细胞在蒸馏水中充足破裂，放出DNA等核物质B.搅拌时，要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌C.在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增长D.在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却E在DNA的溶解和再溶解时，要充足搅拌7．DNA的粗提取中，将与滤液体积相等的、冷却的（D），静置2—3min，溶液中会出现白色丝状物。A.0．9%的NaClB.0.14mol/L的NaCl溶液C.质量分数15%的HClD.体积分数为95%的酒精溶液8.以血液为实验材料时，需要向血液中加入（C），防止血液凝固。A.醋酸钠B.龙胆紫C.柠檬酸钠D.醋酸洋红9.在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（C）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解杂质的速度C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出10.去除滤液中的杂质时，直接在滤液中加入嫩肉粉，运用嫩肉粉中的（C）分解蛋白质。A.胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.肠肽酶二、非选择题（3个）1．提取鸡血中DNA时，要除去血液中的上清液，这是由于什么？答案：由于上清液是血浆，不具有血细胞，DNA存在于沉郁试管底部的鸡血细胞的细胞核中，所以提取鸡血中的DNA时，要除去血液中的上清液。2．填写本实验完毕下列实验操作时所用试剂。⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA：⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA⑷DNA粘稠物的再溶解⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物⑹DNA的鉴定答案：⑴蒸馏水⑵2mol/LNaCl溶液⑶蒸馏水⑷2mol/LNaCl溶液⑸冷却的95%的酒精⑹二苯胺3.关于DNA粗提取的实验材料的选择，也通过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的因素是什么？请回答下列问题：⑴鸡血细胞中红细胞，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中细胞树木较多，可以提供丰富的。⑵实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，重要因素是。⑶生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验规定完毕实验环节后，结果是，这是由于这些动物和人同样，成熟的红细胞中，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行。这是由于。⑷若选用动物肝脏做实验材料，在提取之前，最佳增长程序，使组织细胞更易分离。答案：⑴含细胞核；红；DNA⑵鸡血细胞液中DNA相对含量⑶很难提取到DNA；无细胞核；肝细胞有细胞核⑷研磨【知识拓展】1.二苯胺鉴定DNA的化学原理DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定期溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。2.研磨液中几种药品的作用Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的克制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。【教学反思】课题2多聚酶链式反映扩增DNA片段【课题目的】本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反映）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。【课题重点与难点】课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点：PCR的原理。[导学诱思]1．PCR原理填写下列表格参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链合成子链的原料DNA聚合酶引物DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为，而磷酸基团的末端称为。DNA聚合酶不能开始合成DNA，而只能，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是。在DNA的复制过程中，复制的前提是。在体外可通过控制来实现。在的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为。PCR运用了DNA的原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来的DNA聚合酶的发现和应用，大大增长了PCR的效率。PCR反映需要在一定的缓冲溶液中提供：，，，，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。2．PCR的反映过程PCR一般要经历循环，每次循环可以分为、和三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反映，并且由延伸而成的DNA单链会与结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能，使这段固定长度的序列成指数扩增。3．实验操作在实验室中，做PCR通常使用，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反映体系的配方在中依次加入各组分，，再参照下表的设立设计好PCR仪的循环程序即可。4．操作提醒为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的、、以及蒸馏水等在使用前必须进行。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反映成分时，移液管上的枪头要。[疑难点拨]1.PCR技术简介PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以很少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了由于样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用①解旋酶：打开DNA双链②DNA母链：提供DNA复制的模板③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料④DNA聚合酶：催化合成DNA子链⑤引物：使DNA聚合酶可以从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸）3．DNA的合成方向DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3，端，而磷酸基团的末端称为5，端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3，端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3，端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5，端向3，端延伸。4．PCR的反映过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反映，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处在两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。5．PCR技术与DNA的复制PCR反映是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反映的实质就是DNA复制，所以有关PCR反映的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反映中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反映循环次数。一个DNA片段在30次循环后反映物中大约有10亿个这样的片段。（230）[典例解析]]一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，运用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（）A1/10B1/5C1/16D1/25答案：C解析：一个DNA分子运用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保存复制，其特点是：新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不管通过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样通过n次循环后，标记的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。【课本问题答案和提醒】练习1.提醒：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反映中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反映循环次数。一个DNA片段在30次循环后反映物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1073741824)。2.提醒：PCR引物是根据需要扩增的目的DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感爱好的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。【课堂演练】一．选择题（10个）1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（C）A仅一条作为复制模板B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为本来的双螺旋分子，两条新链结合成一个全新的DNA分子2.下列关于DNA复制过程的对的顺序是（D）①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构A①③④②⑤B①④②⑤③C①③⑤④②D③①④②⑤3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（A）①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录A①②③④⑤B①②③④C①②③⑤D①③④⑤4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（D）①酶②游离的脱氧核苷酸③ATP④DNA分子⑤mRNA⑥tRNA⑦适宜的温度⑧适宜的酸碱度A①②③④⑤⑥B②③④⑤⑥⑦C②③④⑤⑦⑧D①②③④⑦⑧5.运用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，通过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（A）A2B4C8D16，6.关于DNA分子的叙述中，对的的是（C）A.DNA的两条链是极性相同，同向平行B.DNA的两条链是极性相同，反向平行C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的D.DNA的两条链是极性不同，同向平行7.假设PCR反映中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反映物中大约有多少这样的DNA片段（B）A215B230C260D2318.DNA的合成方向总是（C）延伸。A从DNA分子的左端向右端B从DNA分子的右端向左端C从子链的5，端向3，端D从子链的3，端向5，端9.要使PCR反映在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（C）A氧气的浓度B酸碱度C温度D大气的湿度10.DNA分子经PCR反映循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（）A模板母链相同B非模板母链相同C两条模板母链相同D两条模板母链都不相同二．非选择题（2个）1．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，运用这种技术能快速而特异的扩增任何规定的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是：⑵在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要、和、等条件。⑶某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是和个。答案：⑴DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对⑵四种脱氧核苷酸、能量、酶⑶245、3152．将大肠杆菌置于含15N的培养基上培养。这样，后代大肠杆菌细胞中的DNA双链均被15N标记。然后将被15N标记的大肠杆菌作为亲代转到普通培养基中，繁殖两代。亲代、第一代、第二代大肠杆菌DNA的状况如图所示。⑴第一代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息与亲代大肠杆菌DNA贮存的遗传信息完全相同的因素是。⑵假如将第二代大肠杆菌的DNA分子总量作为整体1，其中，带有15N的第二代大肠杆菌DNA分子约占总量的%。⑶假如将第二代大肠杆菌的DNA含量作为整体1，其中含15N标记的第二代大肠杆菌的DNA含量（脱氧核苷酸单链）约占总量的%答案：⑴它们均是以亲代15N标记的DNA双链的每条链为模板，通过碱基互补配对原则合成的⑵50⑶25【参考资料】1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系凝胶浓度要依据DNA分子的大小来拟定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1500个核苷酸的长度，因此根据表4-1选用1％（1g/100mL，下同）的凝胶浓度。表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系琼脂糖凝胶浓度(%)线型DNA分子的分离范围(千碱基对，kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～22.核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而克制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。Tris108gEDTA9.3g硼酸55g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍。3.核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：可以增长样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内；可以在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；可以使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。核酸电泳后，需要染色才干在紫外线下观测到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA双链的碱基对之间，在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入EB，使其终浓度为0.5μg/mL；一种是在电泳后，将凝胶浸入0.5μg/mL的EB溶液中，染色10～15min。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30min后再观测。4.PCR的常见问题PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见因素有：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到克制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量但是关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应一方面在本来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增长5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中具有克制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的规定不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大限度上取决于引物与靶DNA的互补情况，特别需要保证引物的3′端与靶基因互补。PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会导致非目的DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的重要因素。此外，样品中存在靶基因的同源序列也也许导致假阳性结果。为了避免因污染而导致的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等【教学反思】课题3血红蛋白的提取和分离【课题目的】本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生可以体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为此后学习运用这些技术打下基础。【课题重点与难点】课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预解决；色谱柱填料的解决和色谱柱的装填。【导学诱思】1．凝胶色谱法凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。凝胶事实上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程，移动速度；而相对分子质量的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。2．缓冲溶液缓冲溶液的作用是。缓冲溶液通常由溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反映都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。3．电泳电泳是指。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。电泳运用了待分离样品中各分子以及分子自身的、的不同，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是和，在测定蛋白质分子量时通常使用。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于以及等因素。4．蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：、、和。5．样品解决血液由和组成，其中红细胞最多。红细胞具有的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质，其作用是，血红蛋白有个肽链组成，涉及，其中每条肽链围绕一个，磁基团可携带。血红蛋白因具有呈现红色。红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是，采集的血样要及时采用分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层暗红色的倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌，低速短时间离心，如此反复洗涤三次，直至，表白红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放在和作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明液体，这是，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置半晌后，分出下层的红色透明液体。透析取1mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的中，透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于更换样品的。6．凝胶色谱操作第一步要制作，第二步要，由于，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有存在。由于气泡会，减少分离效果。第三步是。【疑难点拨】1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱法也称为分派色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶事实上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个具有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中档的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶自身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其具有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观测颜色来判断什么时候应当收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。3．电泳的作用及其原理电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，运用待分离样品中各种分子带电性质以及分子自身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达成对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。【典例解析】用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（D）A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。【课本问题答案和提醒】（一）旁栏思考题你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？答：凝胶事实上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中档的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。假如凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动顺序，影响分离的效果。（二）练习1．答：凝胶色谱法也称为分派色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶事实上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个具有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中档的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶自身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反映体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反映过程有与体内过程完全相同的pH。3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，运用待分离样品中各种分子带电性质以及分子自身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达成对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，涉及：样品解决、粗分离、纯化和纯度鉴定。一方面通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的解决；再通过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观测颜色来判断什么时候应当收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。[课堂演练]选择题1．凝胶色谱法是根据（B）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（B）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（B）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（A）与氧气的运送有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（C）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（D）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（C）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物非选择题1．电泳运用了待分离样品中各种分子以及、的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。答案：带电性质的差异；分子自身的大小；形状的不同2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？答案：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步。涉及：样品解决、粗分离、纯化和纯度鉴定。一方面通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的解决；在通过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。参考资料聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度1．试剂的配制（1）丙烯酰胺和N,N-甲叉双丙烯酰胺

用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。由于丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会分别缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一反映是由光或碱催化的。因此在每次使用前，应核算溶液的pH不超过7.0；并且应将配制好的溶液置于棕色瓶中，室温贮存，每隔几个月须重新配制。（2）十二烷基硫酸钠（SDS）

用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。（3）用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液

1.5mol/L、pH8.8的Tris缓冲液（分离胶缓冲液）；1mol/L、pH6.8的Tris缓冲液（浓缩胶缓冲液）。（4）TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺)

TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。（5）过硫酸铵

用去离子水配制10%的过硫酸铵溶液。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。（6）Tris—甘氨酸电泳缓冲液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。（7）样品解决液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。（8）染色液

0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。（9）脱色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸取，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验规定和环节，在老师的指导下完毕。操作时要戴好一次性手套。2．电泳（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板。（2）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液。用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2～3mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。（3）分离胶聚合完全后（约30min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（4）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行解决。在电泳样品中按1∶1体积比加入样品解决液，在100℃温度下加热3min，以使蛋白质变性。（6）浓缩胶聚合完全后（30min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（7）按顺序加样，加样量通常为10～25μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品。（8）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm处，关闭电源。（9）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（10）将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1～2h。换脱色液脱色3～10h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内使其不会减少染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。通过本实验的电泳图谱，可以看见提取的血红蛋白的纯度并不是很高。【教学反思】专题知识归纳基础知识：提取DNA的方法实验材料的选取实验设计破碎细胞，获取含DNA的滤液去除滤液中的杂质DNA的粗提取DNA的析出与鉴定与鉴定以血液为材料要防止血液凝固DNA和蛋白质技术操作提醒加入洗涤剂后，动作要轻缓；加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓二苯胺试剂要现配现用结果分析与评价课题延伸PCR原理基础知识PCR的反映过程多聚酶链式反实验操作应扩增DNA操作提醒片段结果分析与评价课题延伸凝胶色谱法血红蛋白的提基础知识缓冲溶液取和分离电泳样品解决实验操作凝胶色谱操作SDS—聚丙烯酰凝胶电泳红细胞的洗涤实验操作色谱主填料的解决凝胶色谱柱的装填蛋白质的分离结果分析与评价课题延伸专题知识检测一、选择题1．DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（C）A.2mol/LB.0.1mol/LC.0.14mol/LD.0.015mol/L2．DNA不溶解于（C）A.NaCl溶液B.KCl溶液C.酒精溶液D.MgCl2溶液3．鉴定DNA的试剂是（D）A.斐林试剂B苏丹Ⅲ染液C.双缩脲试剂D.二苯胺试剂4．在向溶解DNA得NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（C）A.加快溶解DNA的速度B.加快溶解杂质的速度C.减小DNA的溶解度，加快DNA析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出5．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度及其名称分别是（B）①0.1g/ml柠檬酸钠溶液②2mol/LNaCl溶液③0.14mol/LNaCl溶液④体积分数为95%的酒精溶液⑤0.015mol/LNaCl溶液⑥0.04mol/LNaCl溶液A.①③⑤B.③④C.②④D.②③④6．关于DNA的粗提取与鉴定实验的表达哪项是错误的（C）A.离心沉淀的血细胞中加水是为了提取DNAB.NaCl溶液的物质的量浓度为2mol/L时，DNA溶解C.向溶解的DNA烧杯中加蒸馏水是漂洗DNAD.离心后除去血液中的上清液是为了除去杂质7．下列关于实验现象的对的描述是（C）A.向盛有果糖溶液的试管中加入斐林试剂，产生转红色沉淀B.纸层析法分离叶绿体中的色素时，滤纸条上最宽的色素带呈黄绿色C.DNA的粗提取中，第二次加入蒸馏水并搅拌，能析出含DNA的黏稠物D.同一叶片受SO2危害的顺序是先叶柄后叶片8．关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是