分子标记技术20191-(部编)课件

分子标记技术MolecularMarkerTechnology

分子标记技术课程安排一、分子标记技术概述(3)二、DNA的提取、PCR优化与克隆(3)三、显性分子标记技术(ISSR、AFLP)(6)四、共显性分子标记技术(RFLP、SSR)(6)五、分子标记数据的读取方法与分析(3)六、序列测定与分析(3)文献讨论(6-12)

周延清(编著).2019.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京：化学工业出版社郑成木主编.2019.

植物分子标记原理与方法.长沙：湖南科学技术出版社邹喻苹,葛颂,王晓东等.2019.系统与进化植物学中的分子标记.北京:科学出版社

Caetano-AnollesG&GresshoffPM(eds).2019.DNAMarkers:Protocols,Applications,andOverviews.NewYork:Wiley-VchPress.

王中仁.2019.植物等位酶分析.北京：科学出版社参考资料一、分子标记技术概述遗传标记

(geneticmarkers)形态标记(morphologicalmarkers)细胞学标记(cytologicalmarkers)生物化学标记(biochemicalmarkers)分子标记(molecularmarkers)形态标记Color:yellowvswhiteetcTexture:smoothvsroughetcShape:roundvsirregularetc

遗传标记原用于遗传作图，确定染色体上基因顺序（genemapping）

1913年，AlfredH.Sturtevant使用六个形态标记构建了第一个果蝇遗传图谱

1923年，KarlSex发现菜豆数量性状（种子颜色和大小）和数量性状位点之间的遗传连锁（QTL）细胞学标记核型分析(karyotypeanalysis)染色体显带(chromosomebanding)生物化学标记同工酶(isozyme)：电泳所可区分的同一种酶（系统）的不同变化等位酶(allozyme)：由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同

分子标记

或蛋白质序列（大小）(狭义的)指基于DNA分子序列的标记(广义的)指可遗传的、且可检测到的DNA序列是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记

分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的DNA片段

分子标记（molecularmarker）技术产生的原因：（形态性状的局限）基于形态的遗传标记（形态标记）发展到同工酶又到DNA分子标记

DNA分子标记在分子生物学的发展过程中诞生和发展，它能够直接反映基因组DNA间的差异*DNA或cDNA等分子水平上的多态性检测技术*能提供分子标记的分子生物学技术分子标记技术FirstGeneration:1980s

-BasedonDNA-DNAhybridizations,suchasRFLP.SecondGeneration:1990s

-BasedonPCR:Usingrandomprimers:RAPD,DAF,ISSR.Usingspecificprimers:SSR,SCAR,STS

-BasedonPCRandrestrictioncutting:AFLP,CAPs.ThirdGeneration:recently

-BasedonDNApointmutations(SNP),canbedetectedbySSCP,DNAchip,sequencingetc.酶切扩增多态性序列（CleavedAmplifiedPolymorphicSequence，CAP）MolecularMarkersClasses1974年，Grozdicker等人首创了DNA分子标记，即第一代DNA分子标记：限制性片段长度多态性标记（RFLP）

1982年，Hamande发现了第二代DNA分子标记：简单序列重复标记（SSR）

1990年，Williams和Welsh等发现了随机扩增多态性DNA标记（RAPD）

1993年，Zebeau和Vos发明了扩增片段长度多态性标记（AFLP）

1994年，Zeitkiewicz等等发明了简单重复见序列标签（ISSR）

2019年，第三代DNA分子标记SNP诞生随后，大量的分子标记技术被发展了起来宏观微观个体居群生物群落组织细胞分子生态系统器官分子标记的特点对理想的遗传标记的要求：具有高的多态性共显性遗传（鉴别二倍体中杂合和纯合基因型）能够明确辨别等位基因分布于整个基因组中选择中性（即无基因多效性）检测手段简单快速（如实验程序易自动化）开发成本和使用成本尽量低廉在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）DNA分子标记的特点直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题数量极多，遍布整个基因组，可检测的基因座位几乎是无限的多态性极高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造表现为中性，不影响目标形状的表达许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现基于DNA分子标记的分子标记技术大致可分为五大类分子标记技术的类型1）以Southern杂交为基础的分子标记技术限制性内切酶片断长度多态性标记（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）单链构象多态性RFLP（singstrandconformationpolymorphism-RFLP,SSCP-RFLP）变性梯度凝胶电泳RFLP（denaturinggradientgelelectrophoresis-RFLP，DDGCE-RFLP）原位杂交（insituhybridization）RFLP原理示意图DNA的提取基因组DNA的酶解琼脂糖凝胶电泳数据分析Southern印迹转移标记探针杂交放射自显影2）以PCR为基础的分子标记

随机扩增多态性DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）

序列标记位点（sequencetaggedsite,STS）序列特征化扩增区域（sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR）技术随机引物PCR（randomprimer-PCR,RP-PCR）任意引物PCR（arbitraryprimer-PCR,AP-PCR）寡核苷酸引物PCR（oligoprimer-PCR,OP-PCR）单链构象多态性PCR（singlestrandconformationpolymorphism-PCR,SSCP-PCR）什么是STSs：即序列位置标签（SequenceTaggedSite）是指一小段DNA片段（200－500个碱基对），它的精确位置和碱基顺序已经明确的。由于每个STS都是唯一的，一对唯一的PCR引物对应一个STS，通过PCR反应中也可以检测出STS来，STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA的方向和特定序列的相对位置。ETS是cDNA上的STS。

NCBI建有STS数据库，既可以查询STS,也可以提交，url:/dbSTS/index.html

DefinitioninEnglish:ShorttaggedtractsofDNAsequence(200to500basepairs)thatisoperationallyuniqueandhasasingleoccurrenceinthehumangenome.Theirlocationandbasesequenceareknownandthereforetheycanbeusedaslandmarksingenomemapping.

Theycanbedetectedbythepolymerasechainreactioninthepresenceofallothergenomicsequences).Sequence-taggedsitesareusefulformappingthesequencedatareportedfromdifferentlaboratoriesandprovideaframeworkforthephysicalmapofthehumangenome.Theoverwhelmingadvantageofsequence-taggedsitesovermappinglandmarksdefinedthroughothermethodsisthatthemethodcanbecompletelydescribedasinformationinadatabase.

ExpressedsequencetagsaresequencetaggedsitesderivedfromcDNAs.网络资料

小寡核苷酸DNA分析（smalloligoDNAanalysis,SODA）

DNA扩增指纹技术（DNAamplificationfingerprinting,DAF）

扩增片断长度多态性（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AFLP）

相关序列扩增多态性（sequence-relatedamplifiedpolymorphism,SRAP）靶位区域扩增多态性（targetregionamplifiedpolymorphism,TRAP）

插入/缺失多态性（insertion/deletionpolymorphism,InDel

或I/D）RAPD原理示意图DNA提取选择随机引物PCR反应凝胶电泳图谱分析RAPDAFLP3）以重复顺序为基础的标记技术

卫星DNA（satelliteDNA）：碱基对的重复单位为几百至几千微卫星DNA（microsatelliteDNA）：重复单位为2~5个碱基对小卫星DNA（minisatelliteDNA）：重复单位大于5个碱基对

简单重复序列（simplesequencerepeat,SSR）或简单序列长度多态性（simplesequencelengthpolymorphism,SSLP）

短重复序列（shortrepeatsequence,SRS）串珠式重复序列（tandemrepeatsequence,TRS）GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAPCRABCSSRISSR（inter-simplesequencerepeat）---------CACACACACACACACACACACA-------------------------------GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT----------------GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-------------------------------CACACACACACACACACACACACACACACACACA-------5’锚定引物5’锚定引物NNNN(CA)nNNNN(CA)nNN(CA)nNN(CA)n3’锚定引物3’锚定引物----------------------------------------------------------3’锚定引物的PCR产物CACACACACACACACA-------------------------------GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-------------------------------CACACACACACACACACACACACACACA5’锚定引物的PCR产物简单重复序列间区4）以mRNA为基础的分子标记技术

差异显示（differentialdisplay,DD）逆转录PCR（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）

/sciflash/9.htm

差异显示逆转录PCR（differentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRT-PCR）特征性分析（representativedifferenceanalysis,RAD）表达顺序标签（expressedsequencetaqs,EST）序列标位（sequencetaggedsites,STS）基因表达系列分析技术（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）cDNA文库ESTRACE公共数据库全长cDNA克隆电脑克隆基因表达谱分析5）以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术

单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

DNA分子标记多态性的产生有其分子的基础

生物个体在DNA水平上的差异（或多态）是DNA分子标记能进行检测和分析的基础

DNA分子标记多态性的原理PointMutationatrestrictionsites(RFLP,CAPS,AFLP)orPCRprimersites(RAPD,DAF,AP-PCR,SSR,ISSR)B.Insertionordeletionbetweenrestrictionsites(RFLP,CAPS,AFLP)orPCRprimersites(RAPD,DAF,AP-PCR,SSR,ISSR)C.ChangesinthenumberofrepeatunitbetweenrestrictionsitesorPCRprimersites:SSR,VNTR,ISSRD.Mutationsatsinglenucleotides:SNPPolymorphismofDNAMa