PCR核酸扩增仪(部编)课件

分子生物学相关仪器检验学院李平法PCR基因扩增仪DNA测序仪

核酸杂交仪

中心法则转录翻译逆转录复制DNARNA蛋白质

一、分子生物学核心内容前言生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……二、分子生物学的应用前言生物样品DNA片段基因工程核酸杂交基因扩增基因测序表达调控……三、分子生物学的核心技术前言第二节PCR核酸扩增仪原理和应用内容提要PCR核酸扩增仪的工作原理

PCR技术的原理及发展PCR基因扩增仪的工作原理PCR扩增仪的分类与结构

定性PCR扩增仪实时荧光定量PCR扩增仪PCR仪的性能指标、操作规程及常见故障PCR扩增仪的应用内容提要PCR核酸扩增仪的工作原理

PCR技术的原理及发展PCR基因扩增仪的工作原理PCR扩增仪的分类与结构

定性PCR扩增仪实时荧光定量PCR扩增仪PCR仪的性能指标、操作规程及常见故障PCR扩增仪的应用聚合酶链反应

（PolymeraseChainReaction）利用DNA变性、复性和复制的原理，在一对寡聚核苷酸引物的引导下，依靠DNA聚合酶的作用，通过变性-退火-延伸多次循环，将一段特异DNA片段高度扩增的技术。一、PCR技术的原理（一）DNA的结构与复制（二）PCR技术PCR(Polymerasechainreaction)：用一对寡聚核苷酸为引物，通过变性－退火－DNA合成这一周期的多次循环，使目的DNA片段得到扩增。这种扩增产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增倍数可达106。

Dr.KarryMullis1985年发明，获1993年度诺贝尔化学奖。

PCR只是一个简单的不起眼玩艺

——凯利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…

它最大的特点就是能不断推出新形式。

——

摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]

双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA

（变性）↓与一对寡核苷酸引物（5’，3’）降低温度退火

DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火↓适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA（延伸）↓第二轮：变性—退火—延伸呈指数增长理论值：一轮一倍10轮103=1000倍,20轮106,30轮109

理论模板扩增30轮1ng-----------1g

实际模板扩增30轮1ng-----------10

g5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA5

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目录Cycle35

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25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录（二）PCR的反应体系标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：

水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)活性：有5’

3’DNA聚合酶活性；无3’

5’外切酶活性错配率:35轮0.25%,与原始模板有关；最适温度：72℃，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min；95℃40min97.5℃5—6min

变性温度：≤95℃，在整个扩增循环中保持足够活性1.DNA聚合酶pfuDNA聚合酶耐热5’

3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精确度：pfu>Taq

但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu会起到较好效果

2.引物

人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近，每条10-50pmol/100l

◆设计原则：（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同

3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同正链5'—————3'——上游Primer

——下游Primer负链3'—————5'

例如：

IL-3正链

5'GCTCCATGACCCAG-----------GCGATCTTTTGAGTCCAA3'

负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：与其相同下游~：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'

所以负链Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer

一般不要超过3个互补bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果

突变：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'

注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

（4）Primer5’未端可修饰、突变:

（5）primer5’端增加碱基

①内切酶识别点：

（G）GAATTC

GCTCCATGACCCAG

↑保护bp

对PCR产物cloning有很大好处便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同

EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10

如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆∵未切开，连接不上

②ATG起始密码③TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。

3.模板：

可选：DNAmRNA→逆转录→cDNADNA包括：质粒噬菌体染色体DNA

较小较大①目的gene是单拷贝变性较易变性较难②非常大，变性难模板用量

Plasmid:lngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染4.dNTP：四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50

M注意：不稳定，保存时间长会失效

5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+Taq：较少，Mg2+

对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍外界影响：

EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+

结合，降低Mg2+

有效浓度。∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的

Mg2+浓度（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑

（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：

500nt---1min500nt－－3min一般：40－60sec

6.温度和时间：PCR琼脂糖凝胶电泳最终产物紫外光观察3-4小时（四）PCR技术应用基本流程1.PCR技术的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA（1）目的基因的克隆（2）基因的体外突变（3）DNA和RNA的微量分析（4）DNA序列测定（5）基因突变分析

2.PCR技术的应用二、PCR扩增仪的分类与结构PCR扩增仪的种类

普通PCR扩增仪

实时荧光定量PCR扩增仪

梯度PCR仪

原位PCR仪

根据变温模式分类

水浴式PCR仪：由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成。变温金属块式PCR仪：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。变温气流式PCR仪：由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。（一）普通定性PCR扩增仪

由普通PCR仪衍生出的带梯度PCR功能的基因扩增仪。每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，

根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。使用梯度PCR仪，多次实验可在一台仪器上完成，既节省实验时间，提高实验效率，又节约实验成本。

（二）梯度PCR扩增仪由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪。其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。配有支持原位PCR模块的PCR仪可以一机两用，比较经济。（三）原位PCR扩增仪实时荧光定量PCR仪

金属板式实时定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪

各孔独立控温的定量PCR仪（四）荧光定量PCR仪荧光实时定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。PCR仪温度控制水浴锅控温压缩机控温

半导体控温

离心式空气加热控温

三、PCR仪的控温指标和控温方式从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。

（一）PCR仪的控温指标1.温度的准确性：指样品孔温度与设定温度的一致性。对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。2.温度的均一性：指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。

3.升降温的速度：升降温速度快，可以提高工作效率，提高PCR反应特异性。样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。4.不同模式下的相同温度特性：带梯度功能的PCR仪，应考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。现有专利技术，能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度。以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。（二）PCR仪的控温方式由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台机器便可完成整个PCR流程。压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但半导体、金属块上积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度，即overshooting。1.由压缩机自动控温由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，并且仍存在温度overshooting现象。2.半导体自动控温由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致满足荧光定量PCR的高要求，直接发展为离心式的定量PCR仪。金属板式实时定量PCR仪可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致

ABI7500荧光定量PCR仪

MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪

Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪离心式实时定量PCR仪温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差可容纳样品量少，有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能