NGS在肺癌中的应用与报告解读

NGS在肺癌中的应用与报告解读张周燃石医学生物信息总监2017.09NGS检测在肺癌中的应用多基因平行检测---预期检出多少突变？

组织+液体活检---有什么临床价值？

突变丰度---临床意义？NGS检测报告解读案例

提纲/CONTENTS肿瘤是因为基因变异导致的疾病DNARNA蛋白代谢产物分子病理检测NGS一代测序FISHARMSRTPCRIHC肺癌中越来越多的变异被定义为actionable靶点平行检测NCCN指南推荐8基因检测基因型靶向药腺癌人群比例（中国）EGFR突变厄洛替尼42-52%吉非替尼阿法替尼ALK重排/融合克唑替尼6-7%

色瑞替尼HER2突变

曲妥珠单抗~1%阿法替尼BRAFV600E突变威罗菲尼~2%达拉菲尼曲美替尼MET扩增/14外显子跳读克唑替尼~7%ROS1重排/融合克唑替尼1%

塞瑞替尼RET重排/融合卡博替尼~1%KRAS突变K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用~7%TOTAL~70—85%CFDA批准药物应用一：多基因平行检测能够增加患者接受靶向治疗的机会需要很多次传统检测的项目，NGS一个检测即可完成，而且能检测更多位点问题1：到底应该检测多少基因和位点？可根据临床需求和患者经济承受能力选择不同大小的panelEGFR突变ALK重排/融合HER2突变

BRAFV600E突变MET扩增/14外显子跳读ROS1重排/融合RET重排/融合KRAS突变TOTALNCCN指南包括的8基因+扩适应症用药50-60基因（其他癌种上市或在研药物）肿瘤相关通路300-500基因（罕见分子亚型分型，科研需求）问题2：应该检测多少位点？全外显子？基因！=位点基因包含成千上万个位点点突变&插入缺失抑癌基因的全外显子（TP53，RB1）癌基因的激酶区域（ALK/ROS1/RET)融合断点所在内含子(ALK/ROS1/RET)测序读长(150vs.75bp)CNV额外的SNP增强检测

仅外显子是远远不够的有些基因不需要全外显子问题3：预期应该能测到多少个突变？TCGA数据显示，肺癌基因组的突变率为1-10个/Mb(一百万个碱基)问题3：预期应该能测到多少个突变？TCGA数据显示，肺癌基因组的突变率为1-10个/Mb(一百万个碱基)NGS检测能测到多少突变取决于采用多大的panel8基因panel

56基因panel

295基因panel中位检出1个突变 中位检出3-4个突变 中位检出6-7个突变问题4：预期阳性报告占多少比例？阳性报告相关因素Panel大小8基因panel，组织阳性率>78%56基因panel，组织阳性率>92%295基因panel，组织阳性率>95%组织or血液组织中，肿瘤细胞占比？血液中，ctDNA占比？

治疗前后（靶向治疗、放化疗）

病灶大小，是否转移

检测技术

测序深度检测基因型人群比例（中国）EGFR突变42-52%ALK重排/融合6-7%

HER2突变

~1%BRAFV600E突变~2%MET扩增/14外显子跳读~7%ROS1重排/融合1%

RET重排/融合~1%KRAS突变~7%TOTAL~70—85%原发灶和转移灶的基因突变异质性Inter-siteheterogeneity同一瘤灶内基因突变异质性Intra-siteheterogeneity治疗前后基因突变异质性——时间分布差异性LongitudinalheterogeneityNGS与液体活检的结合帮助呈现肿瘤的时空进化全景应用二：肿瘤时空异质性对精准诊疗的影响问题5什么是突变丰度？有何意义？Allele

Fraction(AF)

=

“A”/total

depth=4/14=28.5%突变丰度体现突变的DNA占所有DNA

的比例（肿瘤细胞占比）EGFRL858EGFRL858Wild

type野生型==

“G”Mutation突变型==

“A”丰度反映不同亚克隆的比例关系，可动态监控肿瘤的时空演化肿瘤组织中的突变丰度肿瘤细胞占比66%，突变丰度33%大多数情况下，肿瘤细胞占比不是100%，所以突变丰度一般都会小于50%*在发生拷贝数变异的情况下，突变丰度可能会超过50%正常细胞肿瘤细胞肿瘤组织中的突变丰度与肿瘤细胞占比密切相关问题6组织中的低丰度突变是否意义不大？组织病理评估可以帮助解读肿瘤组织的检测结果，突变的丰度与肿瘤细胞占比密切相关。未有研究表明，低丰度突变不能指导用药。传统ARMS检测不区分丰度*燃石在每一份符合条件的组织样本在检测之前都进行病理评估。绝对丰度与肿瘤细胞占比密切相关相对于肿瘤细胞占比的丰度可能更有意义例：突变丰度4%，肿瘤细胞占比10%再来看血液，什么是cfDNAvs.ctDNAcfDNA

circulating

cell

free

DNActDNA

circulating

tumor

DNA肿瘤负荷大的晚期病人ctDNA丰度高肿瘤负荷小的早期病人ctDNA丰度低组织突变丰度vs血液突变丰度肿瘤组织血检cfDNA突变丰度范围1%

~

99%0.01%

~

99%关键因素肿瘤细胞占比ctDNA

/

cfDNA因素如何评估可病理评估（粗略估计）无法直接评估。利用突变丰度来倒推ctDNA丰度影响因素随机（手术、穿刺切片）肿瘤负荷（病灶大小多少，是否转移）ctDNA有什么特点？丰度低！3000例肺癌血液样本中ctDNA丰度的分布真实世界48.3%样本ctDNA占比不足1%如此低丰度的突变是否有临床意义？ctDNA中的低丰度突变真实存在且有临床意义JThoracOncol.

2017Apr;12(4):663-672在成对血液与组织样本中，血液中检出的丰度为1%以下的突变中82.8%为与组织吻合的突变位点这些突变所对应的组织中突变丰度平均为12%ctDNA中存在大量低丰度突变，且与组织吻合ctDNA丰度可动态监控病程进展合作发表BMCCancer.2016Feb5;16:62血液中的ctDNA突变丰度可以用来推测肿瘤负荷以及不同亚克隆动态变化从而与病人病程相关联ctDNA丰度可动态监控病程进展病例：三代TKI耐药后产生反式C797S，使用一代+三代联合治疗有效合作发表JThoracOncol.2017Jun26ctDNA丰度可动态监控病程进展病例：EGFR一代TKI耐药后产生MET扩增，使用EGFR+MET

TKI联合治疗有效进一步耐药之后产生MET基因Y1248H和D1246N点突变合作发表Clinical

Cancer

Research

2017ctDNA治疗期间转阴可以提示预后血液中的ctDNA经治后转阴的病人预后更好COMPASS研究，submitted化疗亚组靶向治疗组三代TKI组突变的相对丰度T790M/sensitizing

mutation

AFEGFR

L858R

=

5.04%EGFR

T790M

=

0.27%T790M的相对丰度=

0.27%/5.04%

=5.4%T790M相对丰度可以预测EGFR三代TKI疗效突变的相对丰度T790M的相对丰度（RAF）低

可能提示

合并有其他耐药机制NGS报告解读案例病例一MET

14号跳读使用TKI之后继发耐药机制基线检测：MET

exon14skipMET

TKI耐药后检测：MET激酶域点突变NGS可以发现新的耐药机制合作发表Lung

Cancer.2017Sep

16病例二ALK罕见融合对ALK

TKI敏感基线检测：MET

exon14skipNGS可以发现新的耐药机制CEBPZ:exon3ALK:exon20NGS可以检测未知的融合基因精确定位断点，精确区分融合类型发现novel融合基因约86%ALK融合为经典的EML4-ALK融合有14%

为与其他基因的融合，包括：STRN-ALKCATSPERB-ALKACVR1-ALKCLIP1-ALKDPH6-AS1-ALKKIF5B-ALKRP11-320M2.1-ALKUGP2-ALK…DifferentialCrizotinibResponseDurationAmongALKFusionVariantsinALK-PositiveNon–Small-CellLungCancerJCO:

EML4-ALK的不同融合亚型对TKI疗效不同YoshidaT,etal.JournalofClinicalOncology.2016.June27onlineE13:A20E20:A20E6:A20病例三：EGFR

TKI治疗后继发多重耐药机制突变的临床解读临床意义对应靶向药物敏感性、耐药性？敏感可能敏感耐药可能耐药尚不明确Relationshiplevel敏感可能敏感尚不明确可能耐药耐药Implication1FDA/NCCN1AFDA/NCCN1BUnknownFDA/NCCN1BFDA/NCCN1AImplication2Consensuswithhigh-levelrefFDA/NCCNindifferentcancertypeConflictingevidenceFDA/NCCNindifferentcancertypeConsensuswithhigh-levelrefImplication3trialstrialsImplication4case-reportcase-reportImplication5

preclinical

preclinical

突变组合的临床解读没有完全相同的两个肿瘤检测公司提供精准的检测治疗决策则依赖医生的专