芋脱毒种茎生产技术规程

芋脱毒种茎生产技术规程范围本标准规定了芋试管种茎生产所需的仪器设备及化学试剂，培养基配制，材料选取、茎尖脱毒培养，脱毒苗增殖，试管种茎诱导，脱毒种茎移栽与贮存，脱毒种芋繁育的操作规程。本标准适用于芋脱毒种茎的生产。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T29378-2012马铃薯脱毒种薯生产技术规程DB36/T919-2016绿色食品红芽芋DB36/T921-2016红芽芋脱毒种芋繁育技术规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。脱毒苗

应用茎尖组织培养技术获得的再生试管苗，经检测确认不带芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）等病毒，即确认为脱毒苗。脱毒种茎用脱毒苗在无菌环境下诱导形成的微型球茎。原原种利用试管苗在容器内生产的试管芋或在防虫网室内无菌营养基质条件下培养生产出来的、不带病毒、类病毒的种芋。组培所需的仪器设备及化学试剂仪器设备培养基制作及灭菌设备：天平、纯水机、酸度计、高温高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。无菌操作设备：超净工作台、灭菌器等。培养室设备：空调、定时器、培养架、摇床、光栅培养箱、人工气候室等。药品储存与配制设备：冰箱、万分之一天平。观察分析仪器：解剖镜、显微镜、切片机等。常用器皿及器材包括培养器皿（试管、锥形瓶、培养皿及各类专用培养瓶等）、培养基分注器、细菌过滤器、金属操作器械（镊子、剪刀、解剖刀等）、盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。常用化学试剂包括组培苗基本培养基所需的无机盐类、有机物类及植物生长调节物质类等。MS基本培养基成分及母液配制参见附录A；其它常用试剂及植物生长物质的配制参见附录B。培养基制作培养基配制制作培养基前需先配制MS基本培养基母液（配方及配制方法见附录A），配好后4℃保存（保存期不超过180d）。采用附录C方法配制好固体MS培养基，组培瓶分装后放入高压蒸汽灭菌锅（0.1Mpa，121℃）灭菌20min，取出冷却凝固后备用。培养基配方茎尖成苗培养基：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g琼脂粉，pH5.8，固体培养基；组培苗增殖培养基：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g蔗糖+7g琼脂粉，pH5.8，固体培养基；脱毒种茎诱导培养基：MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖+7g琼脂粉，pH5.8，固体培养基；材料选取选择具备多子芋品种（如红芽芋、白芽芋、花果芋等）典型性状的株系，挑选植株健壮、长势良好的子芋球茎作为诱导材料。茎尖脱毒培养茎尖剥离首先，选取符合品种特性、形状规则的子芋带芽球茎，切下0.5cm左右的顶芽或侧芽，剥下外层鳞片2-3层，清水冲洗干净。其次，将芽置于干净烧杯中，在超净工作台上进一步消毒（75%酒精浸泡45s，无菌水冲洗，0.1%氯化汞浸泡8min，无菌水冲洗干净）。第三，将消毒后的芋芽置于解剖镜操作台，用镊子和解剖刀片对芋芽茎尖进行剥离，一手用镊子固定芋芽，一手用解剖刀片进行鳞片剥离，直至将鳞片剥离至可见近似球形茎尖（大小约0.2~0.4mm），用解剖刀片挑起剥离好的茎尖，接种于MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，调pH至5.8左右）试管培养基中。茎尖培养将接种茎尖的试管培养基放置于人工气候培养箱中培养（25℃，4000lx，14h/d），待茎尖长至1个月时，将茎尖移至组培瓶中培养（MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA（30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，调pH至5.8左右）），进一步培养成苗。组培苗病毒检测茎尖培养的组培苗在诱导增殖之前进行病毒检测，芋花叶病毒（DsMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）等病毒，可采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测法（DAS-ELISA）和（或）反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测法，具体检测方法按GB/T29378-2012执行。然后送到国家法定植检部门复检认定，没有检出DsMV和CMV等病毒的脱毒苗，即为脱毒苗。可对脱毒苗进一步进行增殖扩繁。脱毒苗增殖将脱毒苗基部自发根系切除，然后将其转接到增殖培养基上培养（MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA），培养1个月后，将增殖的芽再继续切成单芽在增殖培养基上继代培养，每继代1次单芽可增殖5~7个，每株脱毒苗继代扩繁5次后，可获得3000~4000株脱毒苗。脱毒种茎诱导选取株高4cm~5cm的健壮试管苗，将茎基部自发根系切除，转接到MS+1mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+80g蔗糖固体培养基上，在室温25℃，4000lx光强和16h/d条件下培养，7d后可见脱毒苗基部膨大，40～50d试管芋发育到纵径1.0cm，横径0.5cm以上时可以收获。脱毒种茎移栽收获时将试管芋从培养瓶中取出，用清水多次冲洗，直至洗净表面附着的培养基，种植在灭菌后的草炭+蛭石（2:1）的营养基质中，在人工气候培养室培养成苗，当年收取地下微球茎，作为芋原原种。脱毒种茎贮存从培养基上收获的试管芋洗净后，于阴凉处晾干，再贮藏于透气的容器中，置于4°C条件下保存。试管芋经国家法定植检部门检验合格后，方可作为芋生产用种。脱毒种芋繁育在3月下旬至4月上旬，按照DB36/T919-2016的要求进行生长环境的选择，脱毒种芋的繁育按照DB36/T921-2016的规定实施。附录A（规范性附录）MS培养基母液配方及配制母液成分用量定容每升用量母液1（50倍）NH4NO382.5g1000mL20mLKNO395.0gMgSO4·7H2O18.5g母液2（100倍）CaCl2·H2O44.0g1000mL10mL母液3（100倍）KH2PO417.0g1000mL10mL母液4（100倍）Na2-EDTA3.730g1000mL10mLFeSO4·7H2O2.780g母液5（50倍）H3BO30.31g1000mL20mLMnSO4·4H2O1.115gZnSO4·7H2O0.43gKI0.0415gNaMoO4·2H2O0.0125gCuSO4·5H2O0.00125gCoCl2·6H2O0.00125g母液6（200倍）肌醇20.0g1000mL5mL甘氨酸0.4g烟酸（VB3）0.100g盐酸吡哆醇（VB6）0.100g烟酸硫胺素（VB1）0.020g注：用少量蒸馏水将药品分别溶解，依次混合，加蒸馏水定容至所需体积。附录B（规范性附录）植物生长调节物质母液配制1.称量：用分析天平或电子天平准确称取生长素（或细胞分裂素）50~100mg。2.溶解：生长素（如IAA、IBA、NAA、2,4-D）可用少量0.1mol/L的NaOH或95%的酒精溶解，细胞分裂素（如KT、ZT、6-BA）可用0.1mol/L的HCl加热溶解。3.定容：加蒸馏水定容至100ml，配制成浓度为0.5~1mg/ml的溶液。附录C（规范性附录）MS培养基配制1LMS基本培养基配制：根据培养基成分