渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法

DB32/TXXXX—2020渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定液相色谱-串联质谱法范围本标准规定了渔业养殖用水中16种喹诺酮类抗生素残留量的前处理和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于渔业养殖用水中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、奥比沙星、司帕沙星、氟罗沙星16种抗生素残留量的测定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理水样用混合纤维素滤膜过滤后，喹诺酮类抗生素经固相萃取柱富集、洗脱和净化后，供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料4.1甲醇（CH3OH）。4.2乙腈（CH3CN）。甲酸（HCOOH）。乙酸铵（CH3COONH4）。氨水（NH3·H2O）：优级纯。4.65mmol/L乙酸铵缓冲液：称取0.1925g乙酸铵（4.4），溶于500mL水中。用甲酸（4.3）调节pH为3±0.05。4.75%氨水甲醇溶液：量取5mL氨水（4.5），用甲醇稀释并定容至100mL。0.1%甲酸水溶液：量取1

mL甲酸（4.3），用水稀释至1000mL。4.90.1%甲酸水-乙腈：（9+1，体积比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混合。4.10标准物质：恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixicacid）、恶喹酸（Oxolinicacid）、氟甲喹（Flumequine）、丹诺沙星（Danafloxacin）、双氟沙星（Difloxacin）、奥比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、氟罗沙星（Fleroxacin），纯度≥97.0%。4.11内标物质：氘代诺氟沙星，氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星，纯度≥97.0%。4.12喹诺酮类标准储备溶液：分别称取适量喹诺酮类标准品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10

mL，使各种喹诺酮的浓度均为1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6个月。4.13内标标准储备溶液：分别称取适量内标标准品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10

mL，使各种内标浓度均为1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6个月。4.14混合标准中间溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.12)于100

mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为1µg/mL的混合标准中间溶液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。4.15混合标准工作溶液：根据需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合标准中间液（4.14）稀释成合适的混合标准工作溶液，现配现用。4.16混合内标标准工作溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.13)于100

mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为1µg/mL的混合内标标准工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3个月。注：除另有说明外，以下所用的试剂均为色谱纯，试验用水为GB/T6682规定的一级水。5仪器和设备5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。5.2天平：感量0.01g。5.3分析天平：感量0.00001g。5.4涡旋混合器。5.5氮吹仪。5.6pH计：测量精度±0.05。5.7刻度玻璃离心管：10mL。5.8混合纤维素滤膜：0.45µm。5.9水系滤膜：0.22µm。5.10固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500mg，6mL，或性能相当者。5.11固相萃取装置。6样品制备与保存采集的渔业养殖水样经0.45µm混合纤维素滤膜过滤。如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤2次。过滤后的水样于4℃密封保存，24h内进行检测。——取过滤后的供试样品，作为供试试料。——取过滤后的空白样品，作为空白试料。——取过滤后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。7测定步骤7.1提取和净化依次用6mL甲醇，6mL超纯水，6mL5mmol/L乙酸铵缓冲液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200mL过滤后的试样，加入适量甲酸调节水样pH为3.0±0.05，准确加入1µg/mL混合内标标准工作液50µL（4.16）。然后以约3~5mL/min流速通过固相萃取柱（5.10）。过柱后用6mL超纯水淋洗，再将小柱于氮气保护下干燥20min，最后用6mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分两次进行洗脱。洗脱液于40℃水浴用氮气吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1mL，涡旋混匀1min，过0.22µm水系滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.2标准曲线的制备精确量取适量混合标准中间溶液(4.14)和适量1µg/mL混合内标标准工作液（4.16），用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制成同位素内标浓度为50ng/mL以及16种喹诺酮浓度为1、5、10、20、50、100和200ng/mL系列标准溶液。以被测组分和相应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。7.3测定7.3.1色谱参考条件液相色谱参考条件如下：色谱柱：EC-C18柱，(2.1mmx100mm，2.7µm)，或性能相当者。流速：0.40mL/min。柱温：30℃。进样量：10µL。A为0.1%甲酸水溶液(4.8)，B为乙腈(4.2)；梯度洗脱程序见表1。表1流动相梯度洗脱程序时间/minA相/%B相/%0.009552.00851510.00455512.00109013.0095515.00955质谱参考条件质谱参考条件如下：离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；喷雾电压：5500v；气帘气流量：2

L/min；雾化气流量：8L/min；辅助加热气流量：8L/min；离子源温度：500℃；扫描模式：多反应监测(MRM)，扫描参数见附录A；定性测定在同样测试条件下，试样溶液中各抗生素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±2.5%以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强碎片离子丰度比应符合表2要求。各抗生素的保留时间参考附录B。表2基峰与次强碎片离子丰度比要求次强碎片离子相对丰度%＞50＞20～50＞10～20≤10允许相对偏差%±20±25±30±507.3.4定量测定将标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按内标法进行定量分析，在样品中加入回收率指示物，以此来保证整个样品前处理过程的回收率。诺氟沙星、依诺沙星以氘代诺氟沙星为内标，环丙沙星、洛美沙星以氘代环丙沙星为内标，恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟罗沙星、奥比沙星以氘代恩诺沙星为内标。7.3.5空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。8结果计算试样中喹诺酮类抗生素含量按公式(1)计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。………（1）式中：Xi—试样中喹诺酮类抗生素含量，单位为纳克每升(ng/L)；ci—试样溶液中喹诺酮类抗生素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V1—试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)；m—试样体积，单位为升(L)。9方法灵敏度、准确度和精密度灵敏度本方法的定量限为10ng/L。准确度本方法回收率范围为70%～120%。精密度本方法的批内变异系数≤15%，批间变异系数≤15%。附录A（资料性附录）扫描参数表A.116种喹诺酮类抗生素及内标物的母离子、子离子和碰撞能量序号化合物母离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞能量/V1恩诺沙星36024538316*262诺氟沙星32023335276*263培氟沙星33429027316*304环丙沙星33224532288*265氧氟沙星36226126318*386沙拉沙星38629936342*267依诺沙星32123244303*308洛美沙星35226533308*289萘啶酸233.3215.228187.4*4410恶喹酸26221639244*2611氟甲喹26220225244*4012丹诺沙星35828330340*2413双氟沙星40029938356*3014奥比沙星39629535352*2615司帕沙星39329235349*2716氟罗沙星37026937326*2717氘代诺氟沙星3253073018氘代环丙沙星3403222819氘代恩诺沙星36532129注：*为定量离子附录B（资料性附录）标准溶液液相色谱/串联质谱色谱图和参考保留时间图B.116种喹诺酮标准工作溶液液相色谱/串联质谱XIC色谱图图B.216种喹诺酮标准工作溶液液相色谱/串联质谱TIC色谱图