酶的改造方法进展

关于酶的改造方法进展为什么要进行酶改造？温和的自然体系：常温、常压、中性pH、水环境极端的工业体系：高温、高压、酸、碱、有机溶剂酶不适应第2页,共64页，星期六，2024年，5月酶的改造方法

酶的化学修饰-分子修饰酶的物理修饰-固定化酶的生物改造-定向进化

酶的人工模拟-抗体酶第3页,共64页，星期六，2024年，5月一、酶的化学修饰B通过制备酶单分子纳米凝胶，大大提高了酶的稳定性第4页,共64页，星期六，2024年，5月酶分子修饰主要方法

金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰

第5页,共64页，星期六，2024年，5月1）金属离子置换修饰实例

SOD的金属离子置换：

天然SOD中的铁原子被锰原子取代后，重组酶对H2O2的稳定性显著增强，对NaH3的抑制作用的敏感型显著降低。

氨基酸酰化酶的金属离子置换：氨基酰化酶的锌被钴取代后，底物专一性和最适pH都有改变，锌酶对N-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5,而钴酶是7.0.第6页,共64页，星期六，2024年，5月2）酶大分子修饰的实例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐结合，酶的催化效率提高2.25倍；用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰，在55℃的稳定性比未修饰的提高38%；尿激酶采用聚乙二醇5000修饰，在兔体内的半衰期延长9~13倍；超氧化歧化酶采用聚乙二醇修饰后半衰期延长70~350倍；L-天冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后，抗原性显著降低，1994年经美国FDA批准成为治疗急性白血病的药物使用第7页,共64页，星期六，2024年，5月3）侧链基团修饰的实例用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽链中的Lys残基上的-NH2脱氨变成-OH，酶的半衰期延长2倍；葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰酚基后，最适pH下降0.5，稳定性增加，更有利于果葡糖浆生产；用O-甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中的Lys残基上的

-氨基结合屏蔽，稳定性显著增强；枯草杆菌蛋白酶的第104位Tyr上的酚羟基经四硝基甲烷修饰后，生成3-硝基酪氨酸残基，使酶对带正电荷的底物结合能力显著增强；第8页,共64页，星期六，2024年，5月

胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

4）肽链有限水解修饰实例第9页,共64页，星期六，2024年，5月5）氨基酸置换修饰实例Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。评价：化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个修饰，操作复杂，难以工业化生产；发展趋势：定点突变通过定点突变技术把农杆菌

-葡萄糖苷酶催化中心的第358位L-GluL-Ala，使亲核的羧基

甲基，结果使该酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成第10页,共64页，星期六，2024年，5月酶分子修饰的发展趋势大分子修饰研究最为成功，尤其是聚乙二醇修饰；酶的侧链基团修饰已经成为酶结构研究的重要手段；更为精细的酶侧链修饰往往和结构生物学紧密相关；第11页,共64页，星期六，2024年，5月二、酶的物理改造-固定化

载体固定化：纳米材料、树脂、水凝胶、壳聚糖等无载体固定化：细胞表面自固定化、酶聚集体等第12页,共64页，星期六，2024年，5月10mL淀粉葡萄糖苷酶(350μg/mL)与30mg壳聚糖混合，在室温放置1h，不时搅拌，在4℃过夜，过滤，用600mL蒸馏水洗涤,过滤即得壳聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；第13页,共64页，星期六，2024年，5月海藻酸钠先加热配成溶液，取一定量碱性蛋白酶溶液和海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入2%的CaCl2

中形成凝胶珠，放入4℃冰箱硬化4h，得到海藻酸钠微球。卡拉胶加热配成一定的浓度,50℃水浴保温,加入乳糖酶溶液，均匀搅拌后冷却，4℃冰箱中硬化，得到块状固定化酶；第14页,共64页，星期六，2024年，5月酶与1.5%的海藻酸钠溶液充分混和，通过针头滴入1.1%氯化钙溶液中，形成珠状的海藻酸胶颗粒。凝胶珠用0.5%的聚赖氨酸处理，再经0.1%的2-N-环已胺乙基磺酸处理，用生理盐水洗涤，再以0.05mol/L的柠檬酸钠水溶液液化微囊内海藻酸钙，得到近乎透明的微囊化的固定化酶。第15页,共64页，星期六，2024年，5月DEAE-纤维素固定虫漆酶

CM-纤维素酶固定虫漆酶

第16页,共64页，星期六，2024年，5月吸附交联法：先将酶吸附在硅胶或树脂等载体上，再用戊二醛等双功能试剂交联，所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。制得的固定化酶稳定性好；第17页,共64页，星期六，2024年，5月泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基酰化酶制备L-丙氨酸世界上第一种工业化生产的固定化酶第18页,共64页，星期六，2024年，5月酶固定化的发展趋势载体新材料层出不穷

介孔材料、纳米材料，磁性材料，大孔材料等；固定化方法日新月异

定向固定，微囊化固定，酶聚集体，静电纺丝等；酶的结构与性能研究是热点

结构模拟与计算等；第19页,共64页，星期六，2024年，5月三、酶的生物改造-定向进化

自然界酶的进化是极其缓慢的，无法适应工业过程的需要。随着分子生物学技术快速发展，人们可以在试管内利用几周时间完成自然界几万年的进化过程自然进化诱变育种定向进化上万年几年到十多年几个月第20页,共64页，星期六，2024年，5月酶的定向进化技术发展历程生物催化剂进化方法发展历程随机和定点突变定向进化计算机辅助设计基于序列-功能关系与统计模型的理性进化第21页,共64页，星期六，2024年，5月蛋白质稳定性活性有机溶液中的活性不同的底物的利用酸碱度蛋白质的表达亲和性专一性1234……性能代数达到目的随机突变随机杂交筛选目标蛋白酶定向进化的过程和应用范围第22页,共64页，星期六，2024年，5月酶定向进化的典型例子枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化第23页,共64页，星期六，2024年，5月进化后的枯草杆菌蛋白酶E在60%的DMF中酶催化效率提高157倍，最适温度提高17℃正面反面第24页,共64页，星期六，2024年，5月对硝基苯酯酶的分子进化(LoriGiver等，1998）（在30%的DMF中酶催化活性提高100倍）第25页,共64页，星期六，2024年，5月β-葡糖苷酶耐热性的提高(Marý´aJesu´sArrizubieta等，2000）第26页,共64页，星期六，2024年，5月酶定向进化的基本过程随机突变不同的定向进化方法构建突变基因文库载体的选择，基因重组，组建基因文库突变基因的筛选

平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法

第27页,共64页，星期六，2024年，5月随机突变方法：定向进化的核心无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变有性进化方法

1）DNA改组法（DNAShuffling)2）体外随机重组法（RPR)3）交错延伸法(StEP)基因家族的同源重组外显子的改组杂合进化第28页,共64页，星期六，2024年，5月易错PCR方法第29页,共64页，星期六，2024年，5月有性进化：DNA改组方法（1994，Stemmer)第30页,共64页，星期六，2024年，5月有性进化：体外随机重组法（1998，Arnold)第31页,共64页，星期六，2024年，5月有性进化:交错延伸法（1997，Arnold)第32页,共64页，星期六，2024年，5月基因家族的同源重组无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变有性进化方法

1）DNA改组法（DNAShuffling)2）体外随机重组法（RPR)3）交错延伸法(StEP)基因家族的同源重组外显子的改组杂合进化第33页,共64页，星期六，2024年，5月基因突变库的筛选方法目标根据定向进化要求，在一定的环境要求下进行筛选，从突变基因文库中得到所需的突变基因。难点突变库容量大，一般达到106，工作量巨大关键高通量筛选：通量大，效率高方法平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法第34页,共64页，星期六，2024年，5月平板筛选方法依据细胞生长情况筛选热稳定性：温度梯度和高温环境抗生素耐受性：抗生素浓度梯度pH稳定性：pH梯度极端环境：高盐、低温、高浓毒物质第35页,共64页，星期六，2024年，5月平板筛选方法依据颜色变化筛选大肠杆菌ß-半乳糖苷酶基因显色：噬菌体DNA载体（蓝色）反应产物显色：磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚脂肪酶筛选海因酶筛选第36页,共64页，星期六，2024年，5月平板筛选方法依据透明圈大小筛选淀粉酶的进化：淀粉平板培养基豆鼓纤溶酶的进化：血纤维蛋白培养基第37页,共64页，星期六，2024年，5月荧光筛选方法利用自身荧光激发特性

生成产物本身是具有荧光激发特性的物质利用荧光报告基因辣根过氧化合物酶和单加氧酶的融合基因：原理：萘→萘酚→醌类化合物（能激发荧光）绿色荧光蛋白基因：获2008年诺贝尔化学奖

第38页,共64页，星期六，2024年，5月绿色荧光蛋白的应用分子标记：FISH分析菌株（a）未加探针；（b）DAPI染色（c）α-探针杂交（d）Msint-1268探针杂交菌株Y1；（e）Msint-1268探针杂交M.trichosporiumOB3b第39页,共64页，星期六，2024年，5月噬菌体显示筛选模式第40页,共64页，星期六，2024年，5月噬菌体显示的几种类型第41页,共64页，星期六，2024年，5月核糖体显示技术第42页,共64页，星期六，2024年，5月RNA-蛋白质融合技术第43页,共64页，星期六，2024年，5月RNA-蛋白质的融合第44页,共64页，星期六，2024年，5月酶定向进化的发展趋势定向进化方法发展迅猛

方法均有知识产权；方法更有针对性和特征性；高通量筛选方法是关键

新方法（荧光显示/表面展示）在涌现，技术交叉是趋势；定向进化是近20年中最成功的酶改造方法

新的实例越来越多；第45页,共64页，星期六，2024年，5月

酶对热，酸，碱以及有机溶剂的不稳定性，限制了其在工业中的应用。四、酶的人工模拟模拟酶-----模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全合成法合成的酶。固定化酶

-----结合到特定的支持物上并能发挥作用的一类酶。第46页,共64页，星期六，2024年，5月根据酶的作用原理来模拟酶的活性中心和催化机制，用化学方法制成的高效、高选择性、结构较简单、稳定性较高的新型催化剂。模拟酶利用现有的酶或蛋白质做母体，引入相应的催化机团，形成酶的化学修饰物。以合成的高分子聚合物为母体，根据酶的活性部位结构，连接上所需的功能机团或金属配合物。第47页,共64页，星期六，2024年，5月主客体酶模型：环糊精、冠醚等；胶束酶模型;肽酶；抗体酶：分子印迹酶；半合成酶；杂化酶;模拟酶的分类第48页,共64页，星期六，2024年，5月环糊精模拟酶侧链上接上羟基、咪唑基和羧基，模拟胰凝乳蛋白酶结果：催化对叔丁基苯乙酸酯的水解速度比天然酶一倍第49页,共64页，星期六，2024年，5月分子印迹模拟酶实例模拟结果：以R-1-苯乙醇与月桂酸的酯化反应为模型反应，获得了高效的非水相脂肪酶，印迹酶在有机相中对新构象的记忆时间达几周，极大提高了脂肪酶的对映体选择性。第50页,共64页，星期六，2024年，5月抗体酶抗体的特性1）蛋白质特性2）能高选择配体，专一性与抗原结合3）种类达千万种酶的特性1）大部分为蛋白质2）能高选择性结合底物，催化反应高效进行

1.抗体酶的理论基础第51页,共64页，星期六，2024年，5月第52页,共64页，星期六，2024年，5月12第53页,共64页，星期六，2024年，5月抗体酶催化的应用实例重排反应模拟结果：以椅式构象的氧杂双环化合物为反应的过渡态类似物，制备了催化分支酸为预苯酸的抗体酶，比原反应速度快102-104倍，而且仅催化（—）分支酸。第54页,共64页，星期六，2024年，5月缩合反应第55页,共64页，星期六，2024年，5月转酯基反应第56页,共64页，星期六，2024年，5月酰胺键的形成第57页,共64页，星期六，2024年，5月