(高清版)GBT 40392-2021 循环冷却水中军团菌的检测

ICS13.060.70;13.060.25GB/T40392—2021循环冷却水中军团菌的检测DetectionofLegionellaincirculatingcoolingwater(ISO11731:2017,Waterquality—EnumerationofLegionella,NEQ)国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40392—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国石油和化学工业联合会提出。本文件由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会(SAC/TC63/SC5)归口。华测检测认证集团股份有限公司、中海油天刘娇娇。1GB/T40392—2021循环冷却水中军团菌的检测本文件规定了循环冷却水中军团菌的检测方法。菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27405实验室质量控制规范食品微生物检测GB/T27405界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1军团菌Legionella盐缓冲液的活性炭-酵母提取液(BCYE)培养基上生长的特性。3.2嗜肺军团菌Legionellapneumophila;Lp4通则本文件规定的检测应符合GB/T27403并应在二级生物安全防护实验室(BSL-2)内完成，检出军团菌的样品及培养基应经过无害化处理。2GB/T40392—2021循环冷却水中军团菌数目一般达不到直接涂布检测的数目(10⁵CFU/L),应通过膜过滤浓缩水样液接种到对军团菌具有选择性的GVPC培养基上，经培养生成典型菌落。利用军团菌在活性炭-酵母提取液培养基(BCYE培养基)生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基)不生长的特性，鉴定GVPC培养基上培养出的菌落是否为军团菌，同时用平皿计数法进行计数。在军团菌疾病暴发时或有疑似病例时进一步经生化试验和血清学试验鉴定嗜肺军团菌。6试剂或材料6.1无菌水：应符合GB/T6682—2008中三级水的规定，于121℃±1℃高压蒸汽灭菌20min。6.3活性炭-酵母提取液培养基(BCYE培养基):按附录A中A.1制备或采用市售成品。6.4L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基):按A.2制备或采用市售成品。6.5选择性培养基(GVPC培养基):按A.3制备或采用市售成品。7.2真空泵。7.3超声波振荡器或涡旋混合器。7.4无菌涂布器。7.6普通光学显微镜或荧光显微镜。7.10无菌镊子。8样品采集应在循环冷却水系统投加杀菌剂之前采集样品。如果水样含有氧化型杀菌剂，应在采样前于无菌操作8.2样品采集后应立即送回实验室进行检测，运输时应避免光照和受热。当天不能进行检测时，应在2℃~8℃的冷藏条件下存储或运输，最好在2d内检测，最长不应超过14d。3GB/T40392—2021水样中含有杂质时可静置沉淀或1000r/min离心1min,取上清液备用。在真空过滤系统上安装微孔滤膜，取水样上清液200mL～1000mL过滤，记录过滤水样的体积振荡至少2min(也可将容器放入超声波振荡器中振荡2min～10min,稀释液液面应低于超声波振荡当样品中军团菌的菌落数量超过10⁵CFU/L时，可不进行样品浓缩处理，计数时按直接涂布法计数。9.2.1将9.1.2的浓缩液(无需浓缩时取原液)分成三份。其中一份不做处理，另两份分别采用热处理9.2.2热处理：移取1.0mL浓缩液(或原液)于一无菌容器中，置于50℃±1℃的水浴中加热30min。为2.2,放置5min。接种液均匀涂布于相对应的GVPC培养基平皿的整个表面。将已接种的平板倒置放入CO₂培养箱中，调节CO₂浓度为2.5%,温度为36℃±1℃,相对湿度不小于95%,培养10d。量。在平板上生长小于300个菌落为宜，如有大量军团菌生长，则应减少过滤样品的体积或稀释浓缩液。军团菌的生长可能被其他菌掩盖或抑制，如果怀疑军在GVPC培养基上2d内生长的菌落均不是军团菌。从GVPC培养基上选择3d～10d内生长的疑似军团菌菌落分别接种到BCYE和BCYE-Cys两块培养基上进行培养。如果有不同类型的疑似军4GB/T40392—2021验证。将疑似菌落在含2.5%CO₂的培养箱中36℃±1℃培养2d。凡在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的被确认为军团菌菌落，记录每个平板的结果。如需计数时，计算确认的军团菌菌落数N₁占从培养基上挑取的疑似军团菌菌落数量N的比例。9.7嗜肺军团菌的鉴定在常规监测中可不进行嗜肺军团菌的鉴定，在军团菌疾病暴发时或有疑似病例时应进行嗜肺军团菌的鉴定。取BCYE培养基上经确证的军团菌菌落按附录B进行鉴定。10军团菌的计数10.1直接涂布法水样中军团菌的计数以每升样品中的菌落数X计，单位为菌落形成单位每升(CFU/L),按公式(1)计算：…………式中：a——GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);N₁——确认的军团菌菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);N-—培养基上挑取的疑似军团菌菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);V——接种的原液的体积的数值，单位为毫升(mL)(原液、热处理样品：V=0.1;酸处理样品：V=0.05)。10.2浓缩法水样中军团菌的计数以每升样品中的菌落数X计，单位为菌落形成单位每升(CFU/L),按公式(2)计算：…………式中：a—---GVPC培养基上疑似军团菌的菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);N₁——确认的军团菌菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);N——培养基上挑取的疑似军团菌菌落数，单位为菌落形成单位(CFU);V。——量取的无菌水的体积的数值，单位为毫升(mL)(V.=15.0);V——接种的浓缩液的体积的数值，单位为毫升(mL)(未经处理的浓缩液样品、热处理样品V=0.1;酸处理样品V=0.05);Vtot——过滤水样的体积的数值，单位为毫升(mL)。10.3结果计算分别对未经处理、热处理和酸处理样品接种后培养出的军团菌的数量按照公式(1)或公式(2)进行计算，取结果的最大值作为该水样中军团菌的数量X,此数值为此份样品中军团菌的最大可能数。5GB/T40392—2021团菌的数量X(CFU/L)。6GB/T40392—2021(规范性)培养基与试剂A.1活性炭-酵母提取液培养基(BCYE培养基)酵母提取液(Yeastextract)琼脂活性炭ACES缓冲液(N-2-乙酰胺基-2-乙胺磺酸)氢氧化钾(KOH)L-半胱氨酸盐酸盐焦磷酸铁[Fe₄(P₂O₇)₃]水A.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸和焦磷酸铁的溶解分别用10mL水溶解0.4gL-半胱氨酸盐酸盐和0.25g焦磷酸铁，再用孔径为0.除菌，储存于无菌容器中，于—20℃保存不超过3个月。A.1.2.2ACES缓冲液将ACES颗粒加入到500mL水中，于45℃~50℃水浴溶解。另取480mL水溶解氢氧化钾，轻KOH溶液或0.1mol/LH₂SO₄溶液调节pH值至6.8±0.2。加入琼脂，混合均匀后于121℃±1℃高压蒸气灭菌15min。灭菌后用冷水浴冷却至50℃左右，加入溶解好的L-半胱氨酸盐酸盐溶液和焦磷每皿倾注20mL培养基于直径为90mm～100mm的平皿中制备平板，直径为60mm的平皿用于过滤膜的培养。在室温为25℃时，培养基最终pH值为6.8±0.2。让平皿上的多余水分干燥，在2℃~8℃下于密封容器中避光储存1个月。A.2L-半胱氨酸缺失的BCYE培养基(BCYE-Cys培养基)除不加L-半胱氨酸盐酸盐外，制备方法同BCYE培养基(A.1)。A.3选择性培养基(GVPC培养基)7GB/T40392—2021A.3.1选择性添加剂万古霉素盐酸盐(Vancomycinhydrochloride)纳他霉素(Natamycin)可代替放线菌酮。A.3.2抗生素添加剂的制备A.3.2.1取适量的多粘菌素B(一般为200mg)溶解于100mL水中，使其浓度为14545IU/mL。混匀后进行膜过滤除菌。用无菌管进行分装，每管5.5mL,于-25℃～-15℃保存。使用时，放至室温后再用。每管1mL,于一25℃～—15℃保存。使用时，放至室温A.3.2.3取2g放线菌酮溶解于100mL水中，混匀后，进行膜过滤除菌。用无菌管进行分装，每管4mL,于—25℃～—15℃保存。使用时，放至室温后再用。按照BCYE培养基的制备方法(A.1.2)进行配制，在加入α-酮戊二酸单钾盐后，再加入3g甘氨酸后调节pH值为6.8±0.2。在加入溶解后的L-半胱氨酸和焦磷酸铁后，再加入三种抗生素添加剂(A.3.2),混匀。A.4酸缓冲液A.4.1成分盐酸0.2mol/L氯化钾0.2mol/LA.4.2.1溶液A:0.2mol/L盐酸在1L水中加入17.4mL浓盐酸，混匀。于121℃±1℃高压蒸汽灭菌15min。A.4.2.2溶液B:0.2mol/L氯化钾将14.9g氯化钾溶解于1L水中，于121℃±1℃高压蒸汽灭菌15min。取3.9mL溶液A和25mL溶液B混匀后，用1mol/L氢氧化钾调节pH值到2.2±0.2,置于具塞的玻璃瓶中，该溶液在室温下避光放置不超过1个月。8A.5氧化酶试剂A.5.1成分四甲基对苯二胺盐酸盐1.0gA.5.2制法使用前迅速将上述成分溶于水中。A.6.1成分硝酸钾0.2g蛋白5gA.6.3硝酸盐还原试剂A.6.3.2乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。A.7.1成分蛋白胨氯化钠葡萄糖磷酸二氢钾0.4%酚红溶液琼脂水20%尿素溶液A.7.2制法将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH值，加入琼脂，加热溶化并分装烧瓶，于121℃±1℃高压灭菌15min。冷却至50℃~55℃,加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度应为2%,最终pH值应为7.2±0.1。分装于灭菌试管内，放成斜面备用。A.8营养明胶A.8.1成分9牛肉膏水GB/T40392—2021gmLA.8.2制法加热溶解、校正至pH值7.4～7.6,分装小管，于121℃±1℃高压蒸汽灭菌10min,取出后迅速冷却，使其凝固，最终pH值应为6.8～7.0。A.9马尿酸水解试剂A.9.11%马尿酸钠溶液A.9.1.1成分马尿酸钠1.0gA.9.1.2制法将马尿酸钠溶于水中，在121℃±1℃高压蒸汽灭菌15min,避光保存。A.9.23.5%(水合)茚三酮溶液A.9.2.1成分(水合)茚三酮(ninhydrin)1.75g丁醇25mLA.9.2.2制法将(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液避光冷藏，最多不超过7d。GB/T40392—2021(规范性)B.1总则B.2试剂或材料B.2.4硝酸盐培养基：按A.6制备或采用市售成品。B.2.6营养明胶：按A.8制备或采用市售成品。B.2.7马尿酸水解试剂：按A.9制备或采用市售成品。B.3生化培养法判定嗜肺军团菌B.3.4尿素酶试验：将待检菌以较大量穿刺接种在尿素琼脂培养基上，于36℃±1℃培养2h、4h、4℃±2℃冰箱内10min～30min后再观察结果。仍呈溶解状或表面溶解时即为明胶液