显微镜直接计数法-3可编辑

验——微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数录入时间:2011-4-139:35:15来源：天津农学院精品课程目的1.1

学习接目测微计的校正方法，

了解血球计数板的构造和计数原理1.2

学习使用显微镜测微尺测定微生物细胞大小，

掌握用血球计数板测定微生物细胞总数的方法。2

原理微生物细胞的大小是微生物分类鉴定的重要依据之一。微生物个体微小，必须借助于显微镜才能观察，要测量微生物细胞大小，也必须借助于特殊的测微计在显微镜下进行测量。显微测微计由镜台测微计和目镜测微计两部分组成。后者可直接用于测量细胞大小。它是一块圆形玻片(图7—1)，其中央有精确等分到度，测量时将其放在接目镜中的隔板上。由于目镜测微计所测量的是微生物细胞经过显微镜放大之后所成像的大小，刻度实际代表的长度随使用的目镜和物镜放大倍数及镜筒的长度而改变，所以，使用前须先用镜台测微计进行标定，求出某一放大率下，目镜测微计每一小格所代表的长度，然后用目镜测微计直接测被测对象的大小。镜台测微计是一块中央有精确刻玻片(图7—1)，刻度的总长为lmm，等分为100小格，每小格长10um，专用于对目镜测微计进行标定的。3

材料3.1

器械显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、肾形盘、洗瓶、接种环、酒精灯、火柴、滴管。3.2

菌种培养48h的啤酒酵母斜面菌体和菌悬液。3.3

革兰氏染液4流程4.1

置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测菌体大小→记录结果→用毕擦拭干净4.2

检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗5

步骤5.1

微生物菌体大小的测定5.1.1

目镜测微尺的校正

更换目镜镜头

更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。

某一倍率下标定目镜刻度将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数(图7-1C)。

计算该倍率下目镜刻度

目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um

标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。5.1.2

菌体大小的测定

将啤酒酵母制成水浸片。

大小换算将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。5.1.2一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。5.2

用血球计数板测定微生物细胞的数量5.2.1

检查血球计数板

取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体，若有污物则通过擦洗、冲洗，使其清洁。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。5.2.2

稀释样品将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。5.2.3

加样取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用滴管取1滴菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。静置5—10分钟。5.2.4

镜检待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央五个中格的总菌数。计数时若遇到位于线上的菌体，一般只计数格上方（下方）及右方（左方）线上的菌体。每个样品重复3次。5.2.5

计算

取以上计数的平均值，按下列公式计算出每毫升菌液中的含菌量。菌体细胞数（cfu/mL）＝小格内平均菌体细胞数×400×104×稀释倍数5.2.6

清洗

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。图7-2

血细胞计数板6

结果6.1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。6.2

记录菌体大小的测定结果。6.3

计算样品中酵母菌浓度。7

思考7.1

为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？能找出这种变化的规律吗？7.2

根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？7.3

能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？7.4

根据自己体会，说明血球计数板计数的误差主要来自那些方面？如何减少误差？

8

附录目镜测数尺有两种：一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5

mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(图7-1A)，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。血球计数板是一块特别的厚玻片，玻片中央分剖成两个平面，上面各刻有9区，中央一区为计数室，供计数用(图7-2A)，此区的长和宽各为1mm。中央平面两侧有小沟，小沟外有两条突起的平台，平台比中央平面高0.1mm，因此计数室体积为0.1mm3，容积为10-4ml。通常计数室分为25个大格，每大格又分为16个小格，每小格容积为4×10-6ml，即lml菌液容积相当于400万个小格体积。因此只要将细胞悬液注人计算室，计算出一定数量小格的平均菌数即可算出每毫升的细胞数。显微镜直接计数法基本原理

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（

0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图Ⅷ-1。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图Ⅷ-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图Ⅷ-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图Ⅷ-2。

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数

因1ml=1cm3=1000mm3，

（即0.1mm3中的细菌总数）=A*B*25/5

故1ml菌液中的总细菌数=A*25*10*1000*B/5

=50000A·B（个）

二、器材

酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。

三、操作步骤

1．稀释

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

4．显微镜计数

静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

5．清洗血球计数板

使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

四、实验报告

上一篇：微生物数量的测定下一篇：实验三十一平板菌落计数法实验三十一平板菌落计数法录入时间:2009-1-69:54:00来源：青岛海博生物一、基本原理

平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。

二、器材

大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基，

1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4．

5

ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。

三、操作步骤

1．编号：

取无菌平皿

9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用1ml无菌吸管精确地吸取0．5ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸0．5ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。整个稀释过程如图Ⅷ-3。

3．取样

用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。

4．倒平板

于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。

5．计数

培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：

每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5

一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

平板菌蓓计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并于

37℃温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取

0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。

四、实验报告

环境因素对微生物的影响录入时间:2009-1-615:05:15来源：青岛海博生物微生物的生命活动要求一定的外界环境条件，外界环境条件适宜时，微生物进行正常生长繁殖；不适宜时，则会使微生物生长受到抑制或发生变异，甚至死亡。

不同的环境因素对微生物的影响不同；同一因素因浓度或作用时间不同，对微生物的影响也不一样；有的因素对某些微生物来讲是必需的，而对另一些微生物又是有害的，如好氧微生物必须在有氧条件下才能生长繁殖，而厌氧微生物在有氧情况下将会受到抑制。在有害因素中，有的起抑制作用；有的表现为杀菌作用。

本实验通过化学、物理、生物和营养等环境因素对微生物影响的了解，以便为有益微生物创造适宜的生存条件，而对有害的微生物则设法控制或杀灭，使微生物能更好地为人类所利用。

生物基本知识->实验三十三化学因素对微生物的影响实验三十三化学因素对微生物的影响录入时间:2009-1-615:06:24来源：青岛海博生物一、基本原理

常用的化学消毒剂主要有重金属及其盐类，酚、醇、醛等有机化合物以及碘、表面活性剂等。它们的杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质变性，或者与酶的—SH基结合而使酶失去活性所致。

本实验是观察某些常用的化学药品在一定浓度下对微生物的致死或抑菌作用，从而了解它们的杀菌或抑菌性能。

为了比较各种化学消毒剂的杀菌能力，常以石炭酸为标准，即将某一消毒剂作不同稀释后，在一定条件下，一定时间内致死全部供试微生物的最高稀释浓度，与达到同样效果的石炭酸的最高稀释度的比值，称为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数（酚系数）。石炭酸系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。

二、器材

大肠杆菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus

albus）；

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2．5％碘酒，0．1％升汞（HgCl2），5％石炭酸，75％酒精，1％来苏尔，0．25％新洁尔灭，

0．005％龙胆紫，0．05％龙胆紫；

培养皿，滤纸片，试管，吸管等。

三、操作步骤

1．各种化学药品的杀菌作用

(1)用无菌吸管吸取培养18小时的白色葡萄球菌菌液0．2ml于无菌平皿内。

(2)倒入已溶化并冷至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于上述平皿内，充分摇匀，水平放置，待凝。

(3)将上述已凝固的平皿用记号笔在平皿底划成八等份，每一等份内标明一种药物的名称。

(4)用无菌镊子将小圆形滤纸片分别浸入各种药品中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内，如图Ⅸ-1。

(5)将上述放好滤纸片的含菌平皿，倒置于37℃温室中培养24小时后，取出测定抑菌圈大小，并说明其杀菌强弱。

2．石炭酸系数的测定

（1）将5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同浓度，每管5ml。

（2）将待测药物（来苏尔）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同浓度，每管

5ml。

（3）取肉膏蛋白胨液体培养基30管，1—15管标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理，16—30管标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管，每3管分5、10、15分钟处理。

（4）在上述不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液中，各接入0．5ml大肠杆菌液，摇匀。注意每管自接种时起在5、10、15分钟，用同一接种环从各管内取一环接入上述已标记的液体培养基试管中。

（5）置37℃温室中培养

48小时，观察并记录生长情况。生长者溶液混浊，以“+”表示；不生长者溶液澄清，以“-”表示。

（6）计算系数值

找出在5分钟生长，而在10分钟和15分钟均不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释度，计算二者的比值。例如石炭酸在10分钟内杀死大肠杆菌的最大稀释度是1：70，来苏尔是1：250，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=3．6。

四、实验报告

实验三十四氧对微生物的影响录入时间:2009-1-615:07:49来源：青岛海博生物一、基本原理

各种菌对氧的要求是不同的，根据它们对氧的要求或所能耐受的量可将细菌分为四个类型。专性好氧菌必须在有氧的情况下生存，例如枯草芽孢杆菌；专性厌氧菌则要求在完全无氧的条件下生长繁殖，分子氧对它们有害，例如破伤风梭菌（Clostridiumtetani）、丙酮丁醇梭菌（C．acetobutylcum）等；兼性厌氧菌无论在有氧或无氧的情况下均能生长，一般在有氧情况下生长快，例如酵母菌、肠道杆菌等属于兼性厌氧菌；微好氧菌适宜于在氧浓度较低的环境中生长，例如链球菌属中的个别种。

本实验采用深层琼脂法来测定氧对细菌生长的影响，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂培养基试管中接入某种细菌，通过适宜的培养条件，若细菌只生长在培养基表面，则为好氧菌；只生长在培养基底部，为厌氧菌；若表面及全部培养基中都生长，为兼性厌氧菌；生长在培养基中上部，为微好氧菌（图Ⅸ-2）。这样，根据细菌在试管培养基中生长的部位，就可以判断各种细菌对氧的需要程度。

二、器材

大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，丙酮丁醇梭菌；

肉膏蛋白胨琼脂试管培养基4支。

三、操作步骤

1．将肉膏蛋白胨琼脂培养基试管置于水浴锅中加热溶化。

2．待培养基冷却至50℃左右时，按无菌操作分别用接种环接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌各一环于试管培养基中，另一支试管中不接种作对照。搓动试管，使细菌均匀混于培养基内。

3．待凝固后，置于28℃温室中培养48小时后开始观察，连续观察几天，直至结果清晰时为止。

四、实验报告

实验三十五温度对微生物的影响录入时间:2009-1-615:08:31来源：青岛海博生物一、基本原理

温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时，有刺激生长的作用；不适宜的温度可以导致细菌的形态和代谢的改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡。不同的微生物对温度的抵抗力不同，如大肠杆菌在60℃10分钟内致死，而枯草芽孢杆菌在100℃6—17分钟内才能致死，这是因为芽孢不仅含水量低，有厚而致密的壁，而且还含有特殊的物质——吡啶二羧酸，所以芽孢杆菌的抗热能力比大肠杆菌强。

二、器材

大肠杆菌，枯草芽孢杆菌；

肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，吸管，恒温水浴，温度计等。

三、操作步骤

1．将培养48小时的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌斜面加入无菌生理盐水各5ml，用接种环刮下菌体，制成菌悬液。

2．取肉膏蛋白胨液体培养基试管16支，从1至16编号并注明各管所接菌种的名称和处理的温度及时间。

3．在单号1、3、5、7、9、11、13、15管中各接入大肠杆菌悬液0．2ml，在双号2、4、6、8、10、12、14、16管中各接入枯草芽孢杆菌悬液0．2ml。

4．将已接种的1—8管同时放入50℃水浴中，10分钟后取出第1—4管。再过10分钟（即处理20分钟）后取出第5—8管；同法将接过菌种的第9—16管同时放入100℃水浴中，10分钟后取出第9—12管。再过10分钟（即20分钟）后取出第13—16管。

5．上述各管取出后，立即用冷水冲凉，然后置37℃恒温室内培养24小时后，观察生长情况。

四、实验报告

知识->实验三十六渗透压对微生物的影响实验三十六渗透压对微生物的影响录入时间:2009-1-615:09:12来源：青岛海博生物一、基本原理

若将细菌置于低渗液或水中，菌体因吸收水分膨胀甚至破裂；如果将菌体置于高渗液中，则菌体内的水分就会渗出，结果发生质壁分离现象。不同的细菌对渗透压的抵抗力不同。但不论哪种细菌，对渗透压的抵抗力是有一定限度的，超过一定限度则使菌体生长受到抑制，只有在等渗溶液中，微生物才能正常生长、繁殖，一般细菌在浓盐液或浓糖液中不能生长、繁殖，所以糖或盐可以保存食品。

二、器材

大肠杆菌，酿酒酵母；

含蔗糖量分别为2％、10％、20％、40％的合成培养基，含NaCl量分别为2％、10％、20％、40％的肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌平皿等。

三、操作步骤

1．将不同含蔗糖量和不同含NaCl量的肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化，冷至45℃左右，各倒平皿二个，待凝固。

2．在已凝固的平皿背面用记号笔划成两半，一半划线接种大肠杆菌，另一半划线接种酿酒酵母。

3．于28℃温室中倒置培养4天后，观察其生长情况。实验三十七pH对微生物的影响录入时间:2009-1-615:09:58来源：青岛海博生物一、基本原理

不同的微生物要求的最适pH值不同，一般来说，细菌和放线菌要求中性或微碱性的pH值，而酵母和霉菌则在偏酸的环境中生长。当环境中的pH值超过或低于其适于生长的pH值范围时，微生物的生长就会受到抑制。了解这个特性后，就可以配制不同pH值的培养基来培养不同的微生物，或选择性地分离某种微生物。

二、器材

枯草芽孢杆菌，细黄链霉菌（Streptomyces

microflavus，5406放线菌），酿酒酵母，黑曲霉（Aspergillus

niger）。

盛有豆芽汁蔗糖培养液8ml的试管20支，

0．2mol/L

K2HPO4溶液，0．2mol/L

H3BO3，0．1mol/L柠檬酸溶液，0．2mol/L

NaOH溶液，1ml和2ml吸管若干支等。

三、操作步骤

1．按表Ⅸ-3配制不同pH值的培养基，每种pH值配4管。

2．将配好的培养基，进行间歇灭菌（100℃蒸三次，每次20分钟）。

3．取同一pH值的培养基4管，按无菌操作手续，分别接入枯草芽孢杆菌、细黄链霉菌（5406放线菌）、酿酒酵母、黑曲霉。

4、置28℃温室培养3天后，取出观察结果，并与未接种的培养基对照实验三十八生物因素对微生物的影响录入时间:2009-1-615:10:44来源：青岛海博生物一、基本原理

许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊的代谢产物，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用，例如抗生素。不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用，例如青霉素一般只对革兰氏阳性菌有抗菌作用，多粘菌素只对革兰氏阴性菌有作用，这类抗生素称为窄谱抗生素；而另一些抗生素则对多种细菌有作用，例如四环素、土霉素对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有作用，这类抗生素称为广谱抗生素。

如果将产生某种抗生素的菌划直线接种在豆芽汁葡萄糖琼脂培养基平板上，经培养后，就会长出一条菌带，并产生某种抗生素向菌带周围扩散。再与这条菌带相垂直划直线接种某些不同的试验菌，就会产生不同长度的抑菌带，如图Ⅸ-3。根据抑菌带的长短，即可判断该抗生素对不同微生物的影响。本实验说明产黄青霉产生的青霉素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果。

二、器材

产黄青霉（Peenicillium

chrysogenum）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；

豆芽汁葡萄糖琼脂培养基，无菌平皿，接种环等。

三、操作步骤

1．将豆芽汁葡萄糖琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右倒平板，凝固待用。

2．用接种环挑取产黄青霉的孢子在平板上按图Ⅸ-3，1所示划一直线。

3．接种后，倒置于28℃温室中培养2—3天。

4．待上述平板形成菌苔后，再用接种环从产黄青霉菌的菌带边缘但不要接触菌苔分别垂直向外划直线（图Ⅸ-3，2）接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。

5．倒置于37℃温室培养24小时。

6．观察结果。微生物的生理生化反应录入时间:2009-1-615:11:11来源：青岛海博生物

各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它们是有不同的酶系统。

细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解；第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础，例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。

另一方面，细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和分类方法来利用。

本部分是通过细菌对大分子物质的水解试验、糖发酵试验、鉴定肠道菌的其他不同生化反应和微生物的代谢产物抗生素的测定等几个实验，来证明不同的细菌其生化功能的多样性和微生物之间的互相作用十大分子物质的水解试验实验四十大分子物质的水解试验录入时间:2009-1-615:12:47来源：青岛海博生物一、基本原理

细菌对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶将大分子物质分解。胞外酶能分泌扩散到细胞外，将物质分解成小单位如糖、氨基酸、甘油与脂肪酸。这些小单位的物质能被细菌吸收和利用。水解过程可通过底物的变化来证明，如细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色；水解明胶可观察到明胶被液化；脂肪水解后产生脂肪酸改变培养基的pH，其中的中性红指示剂使培养基从淡红色变为深红色。

二、器材

金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，绿脓杆菌（Bacte-rium

Pyocyaneum）斜面各一支；

油脂培养基，淀粉培养基，明胶培养基，无菌平皿，接种环和接种针，革兰氏染色用卢戈氏碘液（Lugols

iodine

solution）等。

1．油脂水解试验

(1)将溶化的油脂培养基冷至45℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，用无菌操作倒入平皿中，待凝。

(2)将制成的平板用记号笔划成两半，一半接种金黄色葡萄球菌作为对照，另一半接种枯草芽孢杆菌作为试验菌，均用无菌操作画“+”接种，如图Ⅹ-1。

(3)将接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。

(4)取出平板，观察平板底层长菌的地方，如出现红色斑点，说明脂肪被水解，为阳性反应。

2．淀粉水解试验

(1)将淀粉培养基溶化后，冷至45℃左右，以无菌操作制成平板。

(2)用记号笔将平板划成两半，一半接种大肠杆菌作为试验菌，另一半接种枯草芽孢杆菌作为对照菌，均用无菌操作划线接种，如图Ⅹ-2。

(3)将上述已接种的平板倒置于37℃温室中培养24小时。

(4)将已培养24小时的平皿取出，打开皿盖，滴加少量卢戈氏碘液于平板上，轻轻旋转平皿，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解。透明圈的大小、说明该菌水解淀粉能力的强弱。

3．明胶液化试验

(1)取三管明胶培养基，用记号笔标明各管接种的菌名。分别以无菌操作用接种针穿刺接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌。

(2)接种后，置20℃温室中培养2—5天。

(3)观察明胶培养基液化情况（图Ⅹ-3）。

四、实验报告

实验室常用贮存液的配制参数（上）录入时间:2011-4-1910:01:16来源：互联网1.30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器(0.45μm孔径)过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温。

【注意】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。一些价格较低的丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有一些金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积的单床混合树脂(MB-1Mallinckrodt)，搅拌过夜，然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。

2.40%丙烯酰胺

【配制方法】把380g丙烯酰胺(DNA测序级)和20gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml的蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。

【注意】见上述配制30%丙烯酰胺的说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。

3.放线菌素D溶液

【配制方法】把20mg放线菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1：10稀释贮存液，用100%乙醇作空白对照读取OD440值。放线菌素D(分子量为1255)纯品在水溶液中的摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml的放线菌素D溶液在440nm处的吸光值为0.182，放线菌素D的贮存液应放在包有箔片的试管中，保存于-20℃。

【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必须戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在实验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。

药厂提供的作治疗用途的放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要通过测量贮存液在440nm波长处的光吸收确定放线菌素D的浓度，这类制品便可用于抑制自身引导作用。

4.0.1mol/L腺苷三磷酸(ATP)溶液

【配制方法】在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小