王镜岩《生物化学》考研考点讲义

目录综述及绪论 (1)第一章糖类 (8)第二章脂类与生物膜 (21)第三章蛋白质生物化学 (30)第四章酶学 (71)第五章核酸的化学 (88)第六章维生素、激素和抗生素 (101)第七章代谢总论与生物能学 (108)第八章糖代谢 (121)第九章脂代谢 (137)第十章蛋白质降解和氨基酸代谢 (157)第十一章核酸降解与核苷酸代谢 (171)第十二章DNA的复制、损伤修复及重组 (183)第十三章RNA生物合成(转录) (218)第十四章蛋白质的生物合成 (240)第十五章细胞代谢与基因表达调控 (259)第十六章基因工程和蛋白质工程 (279)《生物化学》考点精讲综述及绪论考研专业课《生物化学》王镜岩版考试辅导课程旨在帮助考生通过系列课程的学习，利用最短的时间，取得最有益的成绩，从而达到最终的教学目标。教材特点要根据报考学校的专业侧重点对学习内容有一定的取舍。不一定面面俱到。个别课后题难度较高，只要理解解题思路即可，不一定需要全部熟练记忆。根据报考学校的专业特点注意侧重的内容，如报考医学院校，就要侧重与疾病发生密切相关的生化过程，如脂蛋白与高血脂症、转氨酶与肝炎、脂质过氧化、自由基与细胞损伤、一些激素与疾病的关系等考点分析分为糖的生物化学(约5~10％)、脂类的生物化学(约5~10％)、蛋白质的生物化学、酶生物化学(约30％)、核酸的生物化学(约10~20％)、糖代谢(约10~20％)、脂代谢(约10％)、蛋白质(氨基酸)代谢(约10％)、核苷酸代谢(约5~10％、核酸的生物合成(约10、代谢的调控(约10％)等模块，每个模块在考查中所占比例不同，在复习中要注意。专业：考研专业课《生物化学》王镜岩版考试辅导系列课程：—2—2．名校真题及典型题精讲精练 (一)试卷结构 (二)考题类型考研题的分类：基础知识：各种题型出现，教材上可以找到明确的答案，往往是教学的重点内容，只要认真阅读教材，掌握教学内容，此类试题一般会获得较高分值，此类考题在试题所占分值也较高。(包括基本理)这类知识需要记忆的比较多，譬如一些基本的定义，分子结构特点、代谢的途径，代谢的调控模式理解的前提下记忆，比较容易)分析总结类题目：往往是给出相关的实验现象或者相应的问题，让学生通过学习的专业知识分析推理，从而提相互合适解释或者给出合理的实验方案，一般高水平的大学此类题目所占比例较高，甚至可以达到50％的分值，此类题目可以考查学生对知识的运用能力和分析推理能力，一般以问答题的形式出现。这一类试题由于答案不是完全统一的，不同的答案可能有不同的合理性，所以评分标准相对难以制定，在统考试卷中出现概率相对较低，一般在30％左右。分析总结类题目：有一类题目是将教材中不同的知识模块有机的联系在一起考察，如代谢的调控一章，脂代谢、蛋白质代谢、糖代谢既相互独立但有密切相关，一些激素如胰岛素、甲状腺素、胰高血糖素、肾上腺素等即可以调控糖代谢，也参与脂代谢、蛋白质代谢的调控，既可以反映在酶水平，也可以反映在基因水平，所以可以将不同知识模块结合在一起考察，需要学生对不同模块知识又很好地总结归纳能力。举例：1．假如你从某一动物组织提取一份总RNA样品，可采用一些什么方法检测他的质量(完整性)纯度和浓度，并说明判断的依据。(2009年中山大学考研题)2．假定某蛋白分子量为180Kd，其一级结构可能是直线式的也可能是环式的，试分析是否有可能用简单的合理的方法加以鉴别．(2009年中山大学考研题)3．编码ATP合成酶基因的一突变型已经被鉴定，具有该突变的患者呈现肌无力，运动紊乱、色盲—3—《生物化学》考点精讲性(结果如下表示)，(2011年中国科技大学试题) t1．实验中加入琥珀酸的目的是什么？2．该突变对于琥珀酸－偶联ATP合成体系有什么影响？同时将亚线粒体在加入了ATP，但缺乏琥珀酸的缓冲液中孵育测定ATP酶的活性，结果如下图所示：第三类题目，就是紧扣生命科学发展的前沿的重要事件，或者重要的新技术，在研究中已经广泛运用，而教科书上上没有细致论述的，考察学生对生命科学新发现的了解程度，一方面了解学生对生命科学的兴趣，另一方面考察学生的学习能力，这一类题目在教科书上也没有答案，完全是学生在平时的学习中、日常的交流中获取的一些信息。一般以问答题的形式出现。这一类试题由于答案不是完全统一的，不同的答案可能有不同的合理性，所以评分标准相对难以制定，在统考试卷中出现概率：1．举出两项因有关蛋白质或者核酸研究而获得诺贝尔奖的成果及获奖者。(2011年中国科技大学试题)2．什么是RNA干扰(RNAinterference)？该技术用于基因功能研究与传统的基因敲除方法有什么区别？(2012年中国科技大学试题)3．论述转基因的基本操作步骤及其应用意义，并介绍你所了解的我国动、植物基因工程近年研究进展(可根据自身专业背景任选动物或植物开展论述)(2012年中国科学院研究生院考研试题)—4—4．填空题：2009年诺贝尔化学奖的主要研究成果是，诺贝尔生理学奖的主要研究成果是 5．核糖开关的结构及机制(2012年武汉大学考研题)己去图解反应途径，分子的调控模型等。3．要用基本的生物学观点去理解和思考生命现象中的相关问题：效率和经济的观点，结构与功能相适应的观点。生物是在漫长的进化中产生的，经过长期的自然选择所产生的可以有效适应环境的生命形态，其代谢途径，调控模式在理论上应该是最经济有效的，合理的模式。如三羧酸循环循环是获取能量的重要途径，可以有效地将氨基酸代谢、糖代谢以及脂代谢联系起来，只有几种简单的小分子物质就可以实现物质的合理的转化，糖摄入过多可以储存为脂肪，糖摄入不足，脂类可以分解，蛋白质也可以分解，其调控的只要分子种类如ATP，能荷可以迅速有效地调控代谢的状态。结构与功能相适应的观点是贯穿于生命科学的所有学科，不仅仅是形态结构与功能的相适应，也体现在分子结构与功能的相适应上；甚至代谢行为、宏观的行为与功能的适应如RNA与DNA结构的不同，导致其理化稳定性的不同，而这个与他们承担的生物学功能也是相适应的，DNA的双螺旋结构有效的保证他作为遗传物质实现自我复制的生物学功能。蛋白质结构的柔性，空间结构与功能的关系也保证它的功能可以有效地被调控。如血红蛋白与肌红蛋白的结构的区别可以在功能上反映出来。结构与功能相适应也可以体现在代谢行为与功能的适应性上，如植物的向光性、本能的形成等等，松鼠会在冬天来临之前储存坚果。很多的鸟类会在冬天来临之前迁徙到南方来躲避北方寒冷的冬季。土拨鼠会在冬季来临、食物变少时进入冬眠。—5—《生物化学》考点精讲绪论生物化学是介于生物与化学之间的边缘学科，是利用化学的理论和方法研究生物的一门学科，其任务是阐述构成生物体的基本物质(生物大分子—糖类、脂类、蛋白质、核酸)的结构、性质及其在生命活动(如生长、生殖、代谢、运动等)过程中的变化规律(物质代谢和能量代谢)。研究对象是生物大分子研究目标：揭示生命现象。具体的内容包括：静态生物化学：组成生物体的各种分子如糖、蛋白质、脂肪、核酸的结构特点，及其生物学功能。 (注意生物大分子适应于其相关的生物学功能的结构特点，生物大分子的柔性，次级键的功能等。相关的研究技术，如分离纯化，生物大分子的基本性质等。)核代谢部分的核心也是了解代谢的调控，代谢调控是生物体适应环境、实现自身生理状态或者内环境稳态的内在因素，调控主要是基于生物大分子的功能的调控(通过各种方式利用小分子结合、修饰，亚基构象变化实现酶活性的控制)生物大分子研究的方法，和相关技术原理，如蛋白质分离纯化的技术原理等。学内容的内在规律性，侧重对知识的理解： (一)生物体的组成物质复杂性组成物质多；分子大；空间结构复杂。结构的复杂性预示着功能的复杂性；空间结构多为次级键决定，所以结构变化影响因素多。规律性元素→构件小分子→聚合物(生物大分子)；结构与功能相适应。 (二)物质和能量代谢·复杂性·多步化学反应构成代谢途径；·多条代谢途径相互交织成网；—6—·物质代谢和能量代谢相互交织；·调节控制有条不紊·规律性·反应类型不多；·反应机理符合有机化学理论；·调节控制与生物学功能相适应。 (三)信息分子的生物合成·复杂性·合成过程复杂；·调节控制复杂；·与生命现象的关系复杂。·规律性·遗传密码已经破译；基因表达的基本过程已经清楚；·生物大分子结构与功能的关系逐渐明晰；生物化学的建立源于化学的发展，在无机化学、有机化学逐渐发展的过程中，对于生物有机体的化学组成有了逐渐深入的认识，逐渐认识到生物有机体在化学组成、物质转化规律上与无机自然界遵循相同的理化规律，生命现象的实质是各种复杂的反应的结果。生物化学发展史上的重要事件年Buchner发现酵母细胞裂解液能使糖发酵1944年Avery等人证明遗传信息在核酸上早期生物化学研究的重心是代谢研究和结构研究。Perutz体结构1972年DNA重组技术的建立1978年DNA双脱氧测序法的成功1年完成。现在的研究侧重蛋白质、核酸的生物学功能研究，信息传递及调控。生物化学教学内容的线索之一：生命体组成的物质转化代谢途径和规律；(动态生物化学的研究—7—《生物化学》考点精讲内容)各种生物大分子的结构特点及其生物学功能。(静态生物化学，着重从结构与功能的相关性去理解结构特点，结构特点同时蕴含了生物大分子的研究技术)线索二：大分子研究技术及其原理。五、生物化学的生物化学中的关键技术及其原理·电泳(1923)生物大分子的分离、分析·超离心(1925)蛋白质、细胞亚器官的分离；分子量的确定·同位素标记(1934)物质代谢途径、生物大分子结构测定·层析(1944)生物大分子的分离纯化·分子杂交技术·基因工程相关技术六、生物化学在生命科学中的学科地位全称是生物化学与分子生生物学，。在硕士入学考试中，生物化学的内容是包含了分子生物学相关内容的。尤其是基因工程相关技术及其应用的内容。生物化学是生命科学中的基础学科，工具性学科，生命科学发展到今天，对生命现象的理解已经从原来的形态学观察、非定量的描述性的科学逐渐发展到可以定量的、通过实验进行精确研究的科学，侧重于从生物大分子功能的角度去解释相关的生命现象。生物化学的学习为研究和理解生物大分子功能研究提供了相应的技术手段，包括生物大分子的分离纯化、结构、功能及其调控的，酶学研究技术、分子生物学研究技术。生物化学与分子生物学是生物学的最深层次，是从分子水平认识生命现象的学科，为其他学科提供了相应的研究技术手段。所以生物化学是生命科学的基础学科，是研究的工具。教学内容中，不仅要注意其基本的理论，而且要特别注意相关的研究技术及原理的理解，第一章糖类知识要点结构。3．熟悉细菌杂多糖、糖蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖的结构多样性和各自的主要生物学功能；了解糖链结构分析的基本方法。一、糖类的生物学作用绿色植物的皮、杆等的多糖(纤维素、半纤维素和果胶物质等)；昆虫、蟹、虾等外骨骼糖(几丁质)；结缔组织中的糖(肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等)；细菌细胞壁糖称作结构多糖；—结构物质粮食及块根、块茎中的多糖(淀粉)；动物体内的贮藏多糖(糖元)是重要的能源物质；—能源储存物质糖蛋白(蛋白聚糖)中的糖；细胞膜及其他细胞结构中的糖如血型糖；活性糖分子是重要的信息分子；—信息分子)；食用菌中的糖(香菇多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、昆布多糖等)可以作为药物使用；—特殊生理活性糖类是重要的中间代谢物，可以转化为氨基酸、核苷酸和脂类。—中间代谢物通式：(CH2O)n，但仅从通式上并不能判断某分子是否就是糖，即：符合通式的不CHO 糖类可以定义为：多羟基醛；多羟基酮；多羟基醛或多羟基酮的衍生物；可以水解为多羟基醛或多羟基酮或它们的衍生物的物质。—9—《生物化学》考点精讲酸皮肤素等。乙酰氨基葡萄糖、糖的硫酸酯等；葡萄糖及绝大多数糖都有使平面偏振光发生偏转的能力，即糖的旋光性，是因为糖都具有手性碳。糖的旋光性和旋光度由糖分子中的所有手性碳上的羟基方向所决定。糖的旋光性以右旋(以d或＋表示)或左旋(以l或－表示)。8．构型是指一个分子由于其各原子特有的空间排列而使该分子具有特定的立体化学结构。当一个物质由一种构型转变为另一种构型时，要求有共价键的断裂或重新形成。表明一个物质应有其特定的构型。对映体结构的示意图糖的构型与旋光性之间不一定相对应，即D型不一定代表右旋、L型也不一定代表左旋，因为两 D9．构象指一个分子中，不改变共价键结构，仅靠单键的旋转或扭曲而改变分子中基团在空间的排《生物化学》考点精讲布位置，而产生不同的排列方式。根据X－射线晶体分析，葡萄糖吡喃环与环己烷的椅式结构相似，b－葡萄糖的可能构象有2种椅式(A，B)和6种船式，主要是A椅式。的缩写12．糖苷是以酚类，固醇类，含氮碱等为配基的单糖或寡糖衍生物，大多有苦味或香气，不少有毒，但少量使用有药理作用．状结构，内侧疏水，外侧亲水，可以使疏水物质形成水溶性的包含络合物，增加被包含物质的稳定性。由许多单糖或单糖衍生物聚合而成，缩合时单糖分子以糖苷键相连，一般无甜味、无还原性、酸或糖和杂多糖。18．糖原：有动物淀粉之称，细菌细胞中也有存在，动物组织内主要的贮藏多糖。肝脏、肌肉中含II高压和酸，人体消化酶不能水解纤维素，食草动物利用肠道寄生菌分泌的纤维素酶(cellulase)将部分纤维素水解为葡萄糖。对分子质量平均在75000左右的为高分子右旋糖酐。高分子右旋糖酐是一种血浆代用品，用于提高血浆胶体渗透压，能将组织的水分渗透到血中，维持血容量，临床用于出血性休克和创伤性休克。相对分子质量在20000－40000的为低分子量右旋糖酐，主要用于降低血液粘滞度，防止血栓形exNDb键缩合而成，分子线状不分支。《生物化学》考点精讲品和化妆品制造等。木质素后，用螯合剂如草酸铵水溶液提取获得。果胶物质通常由聚半乳糖醛酸或聚鼠李糖半乳糖醛酸构成主链，阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖等构成侧链；羧基的甲基化大于45％称高甲氧基果胶，小于45％称低甲氧基果胶，羧基大部分被甲基化的为果胶酯酸，与纤维素半纤维素等结合成水不溶的原果胶，经稀酸或果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)去甲基化后，水溶性增强，果实变软。可用于食品加工。控制果胶酶可延长果品蔬菜的保藏期。木葡聚糖的总称。常有侧链和修饰基团。木质素是酚类形成的聚合物，不属于糖类。6－脱水－L－吡喃半乳糖交替组成的线形链。琼脂可用于食品工业，琼脂胶的糖基不同程度地被硫酸基、甲氧基、丙酮酸等修饰。琼脂糖可形成左手双螺旋，再聚集成束，形成刚性的交联凝胶网，可用做电泳和层析的支持物。酶；人造海蜇)、树胶等主要在食品、制药、印染等领域26．凝集素(lectin)凝集素可定义为能与糖类专一性非共价结合，并能够凝集细胞和沉淀寡糖及其复合物的非抗体蛋白质或糖蛋白。 (凝集素可分为很多类，(植物凝集素，动物凝集素、微生物凝集素)豆类根瘤菌与宿主之间的选择性是由凝集素介导的。微生物对宿主的感染也是由凝集素介导的，细菌凝集素存在于细菌表面的菌毛上，与靶细胞的黏着具有物种和器官的专一性。动物凝集素的结构复杂，种类繁多，与炎症、肿瘤转1．革兰氏阳性菌的细胞壁由多层网状的肽聚糖和磷壁酸组成，革兰氏阴性菌的细胞壁由单层肽。2．革兰氏阳性菌的细胞壁由多层肽聚糖与磷壁酸组成，肽聚糖二糖四肽重复单位的四肽侧链之间由1－5个氨基酸组成的肽交联桥连接3．肽聚糖是由二糖四肽重复单位连接成的网状的囊形结构。也可看成壳多糖的单糖残基交替地被乳酸取代，并通过它连接四肽形成的网状结构。4．磷壁酸：革兰氏阳性菌的磷壁酸主链由醇和磷酸交替排列而成，可分为核糖醇磷壁酸和甘油磷壁酸。跨过肽聚糖连接于质膜寡糖基的称脂磷壁酸，与肽聚糖的N－乙酰胞壁酸连接的称壁磷壁酸，与细胞的生长和抗原性有关。的重要原因。包含两个部分。脂质A：和杂多糖共价结合而成。杂多糖又可以分为核心寡糖和O－特异链。脂质A：两分子D－葡糖氨通过糖苷键连接的二糖单位重复而成，二糖单位两端端C1和C4各有一个磷酸基，重复单位通过C1和C4间的焦磷酸桥连接；二糖单位的其他碳位被脂肪酸酯化。原端通过中性七碳糖与中性糖构成的外核心相连，核心寡糖可作为噬菌体的受体，还与细菌的抗原性有关。原性，故可称为O－抗原，含有O－特异链脂多糖的细菌在琼脂板上可长成光滑菌落，称作S－型细1．糖蛋白：糖链作为蛋白质的辅基的一类蛋白质。(糖链较短，一般小于15个单糖单位，称寡糖2．糖胺聚糖：(glycosaminoglycan，GAG)：是胞外基质的重要成分，由己糖醛酸和己糖胺重复二糖单位构成，二糖单位常被带负电荷的羧基或硫酸基修饰，因此呈酸性。(糖胺聚糖的主要作用有：保持结缔组织的水分；调节阳离子在组织中的分布；对关节的保护和润滑作用；促进创伤愈合的作用。糖连接而成，糖的含量高于蛋白质，糖部分主要是不分支的糖胺聚糖，存在于细胞外基质、细胞表面及细胞内的分泌颗粒中。字，由4种不同的单糖可形成36864种不同的4聚糖异构体。即β－构型的N－乙酰葡糖胺异头碳与天冬酰胺的γ－酰胺N原子形成的糖苷键，在血浆蛋白和糖蛋白中分布广泛．O－糖肽键：即单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基氧原子形成的共价键。包括：乙酰半乳糖胺与丝氨酸或苏氨酸形成的糖肽键，主要存在于黏液蛋白和某些球蛋白。半乳糖胺与羟赖氨酸形成的糖肽键，主要存在于胶原蛋白。呋喃阿拉伯糖与羟脯氨酸形成的糖肽键，主要存在于植物，包括细胞壁的伸展蛋白和凝集素等。6．糖蛋白的生物学作用A．促进新生肽链的正确折叠：基因定点突变法获得的一些去糖基化糖蛋白不能正常折叠，也不能形成正常的聚合体，基因工程中真核细胞表达的糖蛋白因含有糖链而不发生聚集，可分泌到胞外，原核生物的表达产物不能糖基化而聚集成包含体。B．促进分泌蛋白的分泌及其稳定性。C．参与分子识别和细胞识别。如血浆中老蛋白质的清除：不少血清糖蛋白含有以唾液酸残基为末端的N－糖链糖蛋白，当末端的唾液酸残基被血管壁上的唾液酸酶切除，暴露出半乳糖残基后，可被肝细胞膜上的受体识别，通过胞吞被肝细胞内溶酶体降解。末端唾液酸残基被切除的速率与蛋白质本身结构有关，决定着蛋白质的寿命。精子和卵子的识别：哺乳动物卵子外层的糖蛋白透明带上的糖链能与精子表面的凝集素受体识别，引发精子头部的顶体释放蛋白酶和透明质酸酶使透明带水解，精子核进入卵内。糖链与细胞黏着：组织中细胞与细胞之间充满由糖蛋白、蛋白聚糖和透明质酸组成的胞外基质 似的机制，肿瘤细胞的转移和归巢与黏着蛋白介导的黏着行为有关．D．糖链与糖蛋白的生物活性有些酶是糖蛋白，糖基对酶的活性的影响因酶而异。一些蛋白类激素如促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)、红细胞生成素 (EPO)等均为糖蛋白，糖蛋白糖链对激素的活性及寿命的影响因激素而异。IgG是含糖链的蛋白，糖链缺失可以引起相关的自身免疫病。红细胞表面的血型抗原称凝集原；血清中含有的凝集原的抗体称凝集素，而凝集原的基因凝集原的血型决定族是寡糖，血型基因是一些专一性糖基转移酶。构成，二糖单位常被带负电荷的羧基或硫酸基修饰，因此呈酸性。糖胺聚糖的生物学作用有：保持结缔组织的水分；调节阳离子在组织中的分布；对关节的保护和润滑作用；促进创伤愈合的作用。高于蛋白质，糖部分主要是不分支的糖胺聚糖，存在于细胞外基质、细胞表面及细胞内的分泌颗粒中。大分子聚集型胞外基质蛋白聚糖：存在于胞外基质，主要存在于软骨，小分子富含亮氨酸胞外基质蛋白聚糖：主要存在于胞外基质，分子较小．跨膜胞内蛋白聚糖：存在于细胞膜或细胞内，种类繁多，结构和功能各异。六、糖链结构分析及与糖相关的反应用分离蛋白质的方法纯化糖蛋白；用酶法或化学法断裂糖苷键，释放聚糖；用超离心、电泳、高效凝胶渗透层析等方法鉴定聚糖纯度；用酸或无水甲醇分解聚糖，用色谱法鉴定单糖种类；用多种方法部分分解聚糖，分别用质谱法等方法测序，推断拼接出聚糖序列。2．用于糖链结构测定的一些方法1．用高碘酸氧化和Smith降解，不同的糖苷键位置产生不同的降解产物，降解产物可用气液色谱或薄层色谱鉴定；(高碘酸可以选择性地氧化和断裂糖分子中连二羟基或连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量地进行，每开裂—个C－C键消耗一分子高碘酸。通过测定高碘酸消耗量及甲酸的释放量，可以判断多糖分子中糖苷键的位置、类型、多糖的分枝数目和取代情况等。高碘酸及其盐可以定量地氧化断裂邻二羟基、α－羟基醛等的碳－碳键，生成相应的羰基化合物，顺式邻二羟基化合物比反式的氧化速度快。Smith降解是将高碘酸氧化产物用硼氢化合物(如硼氢化钾或硼氢化钠)还原成稳定的多羟基化合物。然后进行适度的酸水解，用纸层析鉴定水解产物，由水解产物可以推断多糖各组分的连接方式及次序)进行定性定量分析，确定糖基的连接位置；3．综合使用外切糖苷酶和内切糖苷酶推断寡糖序列；4．用红外光谱、拉曼光谱或质谱法(快速原子轰击质谱，FAB－MS)分析糖链结构。考1．葡萄糖环状结构的证据A．Schiff化反应不灵敏，不能使被H2SO3漂白的品红转呈红色；B．不能与NaHSO3起加成反应C．葡萄糖水溶液有变旋现象醛糖的C1或酮糖的C2能产生a－和b－一对差向异构体，在水溶液中很快互相转变为混合物，即溶解过程会发生旋光度的改变，即为变旋现象，这是a和b异头物自发互变所导致的。新配制的葡萄Schiff如加成、氧化等则可通过平衡移动完成。单糖链状结构的的证据：A．葡萄糖可与Fehling试剂或其他醛试剂反应T醛基B．葡萄糖与乙酸酐结合，产生有5个乙酰基的衍生物T5个羟基存在C．葡萄糖与钠汞齐(Na、Hg的合金)作用，被还原为一种具有6个羟基的山梨醇(Sorbitol，gloci-证明葡萄糖的结构是六个碳连成直链的分子。单糖的化学性质主要体现在多羟基醛、或多羟基酮的化学结构特征上，具有一切羟基及多羟基的反应，如氧化、酯化、缩醛反应；也有醛基或羰基的反应；同时还有基团间相互影响而产生的一些特殊的反应。4．糖的还原性主要体现在其醛基上，所以无醛基的糖不表现出明显的还原性，果糖在碱性溶液中可以异构化形成醛糖而具有还原性。麦芽糖有游离的半缩醛羟基，所以具有还原性，而蔗糖是由一分从非还原端开始降解(很多酶的作用特点)。5．淀粉的显色特性：淀粉—红糊精－无色糊精－麦芽糖－葡萄糖改变分子中基团在空间的排布位置，而产生不同的排列方式。根据X－射线晶体分析，葡萄糖吡喃环与环己烷的椅式结构相似，葡萄糖的可能构象有2种椅式(A，B)和6种船式，主要是A椅式。2．淀粉和纤维素都是有葡萄糖组成的？为什么人只能消化淀粉而同为辅乳动物的牛羊等食草动物却能以纤维素为食？(广东海洋大学2009)哺乳动物缺乏分解纤维素的酶，所以人只能……，食草动物肠道细菌可分泌……3．变旋性新配置的溶液的旋光度会发生改变的现象称作，实质是由于分子的立体结构发生变化的原因。4．淀粉有还原性。(判断正误)5．果胶为同聚多糖。(判断正误)6．肝素属于糖胺聚糖(判断正误)(糖胺聚糖主要有透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素、肝素等。不同种类单糖残基连接键、硫酸基的位置及数目不一样)7．直链淀粉是由通过糖苷键连接而成的大分子。8．蔗糖没有还原性而麦芽糖有还原性，果糖没有还原性(判断正误)。(青岛科技大学，2012))9．血型是由糖酯的特性决定的(判断正误)。10．细胞膜上的糖蛋白，其糖基均位于膜外一侧(？)—20—11．蛋白质糖基化位点一般是羟基氨基酸或酰胺氨基酸残基()12．麦芽糖是由两个葡萄糖分子缩合、失水形成的，其糖苷键类型为α(1→4)，麦芽糖分子内有一个游离的半缩醛羟基，具有还原性。和 。14．糖原分解过程中磷酸化酶催化磷酸解的键是()15．下列多糖中属于杂多糖的是(昆明理工大学2010)16．ABO血型决定簇抗原是红细胞表面的(中国科技大学，2010)17．O－糖肽键：即单糖的异头碳与羟基氨基酸的羟基氧原子形成的共价键。18．1．N－糖肽键β－构型的N－乙酰葡糖胺异头碳与天冬酰胺的γ－酰胺N原子形成的糖苷键，在血浆蛋白和糖蛋白中分布广泛．19．异头物：单糖形成环状结构时，原来的羰基转变成羟基时形成的两种不同构型(α或β)的同分异构体。异头物是指在羰基(carbonyl)碳原子上的构型彼此不同的单糖同分异构体形式。D－glu-cose的α－和β－型即是一对异头物．它们是非对映异构体。(中国科学院研究生院2012)20．下列有关糖苷性质的叙述正确的是(中国科学院研究生院2012)B．在稀NaOH21．下列糖不具有变旋现象的是(中国科学院研究生院2012)AB．乳糖C．淀粉D．半乳糖24．下列糖分子中那一对互为差向异构体(24．下列糖分子中那一对互为差向异构体()(中国科学院研究生院2012))D．L)(中国科学院研究生院2012))、下列不属于同多糖的是()ABC、下列不属于同多糖的是()26．糖蛋白上的寡糖链有何功能(中山大学，2005)—21—第二章脂类与生物膜知识要点结构；脂肪的基本性质；生物膜的基本结构与功能。2．熟悉脂肪酸的命名，常见脂肪酸的书写方式和命名规则；磷脂的生物学功能和常见磷脂的结构3．熟悉脂质过氧化的化学过程；脂质过氧化对机体的损伤；抗氧化剂保护机制；了解鞘磷脂的结构特点和生物学功能。4．具备研究脂类及其衍生物、生物膜结构与功能的基本素质和能力。脂质的定义及其生物学作用1．脂质的定义：脂质是低溶于水，高溶于非极性溶剂的有机分子。(化学结构的多样性) (天然脂肪酸的双键多为顺式，少数为反式)2．必须多不饱和脂肪酸(PUFA)：亚油酸是ω－6家族PUFA的原初成员，也是二十碳烷化合物前体，α－亚麻酸是ω－3家族PUFA的原初成员，ω－6家族PUFA可降低血清胆固醇，ω－3家族PUFA可显著降低血清甘油三酯，防治神经、视觉和心脏疾病，人类可能缺乏ω－3家族PUFA。EPA (20碳五稀酸)和DHA(22碳六稀酸)有保健价值。类二十碳烷类二十碳烷是由20碳PUFA衍生而成的，包括前列腺素、凝血烷和白三烯等，合成的前体主要是花生四烯酸。前列腺素存在广泛，种类较多，不同的前列腺素或同一前列腺素作用于不同的细胞，产生不同的凝血烷最早从血小板分离获得，能引起动脉收缩，诱发血小板聚集，促进血拴形成。白三烯最早从白细胞分离获得，能促进趋化性，炎症和变态反应。—22—阿司匹林消炎、镇痛、退热的原因是抑制前列腺素的合成，也抑制凝血烷合成，因而有抗凝血作用。用 RS是R，逆时针就是S；如果最小基团在横线上，其它基团由大到小是顺时针，就是S，逆时针就是R。甘油取代物的构型：以手性碳原子为中心，S(反时针)－原羟甲基(增加该基团优先性时，手性原中心为S－构型)为1位，R(顺时针)－原羟甲基(增加该基团优先性时，手性原中心为R－构型)为3位，称作立体后顺序，如在排列最后的原子或原子团“”的对面去观察其余三个基团的排列顺序，从最优先的基团到第二优先的基团到第三优先的基团即，如果它们是按顺时针方向排列，那么这个构型称为型，如果它们逆时针方向排列，那么这个构型称为型如)。1．三酰甘油能在酸、碱或酶作用下水解成脂肪酸和甘油，碱水解称作皂化，皂化1g油脂所需的2．油脂中的双键氢化可制造人造黄油；油脂中的双键还可与碘反应，100g油脂所能吸收的碘的克数称作碘值；1g油脂中乙酰基释放的乙酸所需的KOHmg数称作乙酰价；作酸价；5．蜡是长链脂肪酸和长链一元醇或固醇形成的酯，天然蜡是多种蜡酯的混合物。(蜡分子含一个很弱的极性头和一个非极性尾，因此完全不溶于水，蜡的硬度由烃链的长度和饱和度决定。1．自由基：含有奇数价电子并因此在一个轨道上有一个未成对电子的原子或原子团，反应活性极2．自由基链式反应：有少数自由基诱导产生反应，反应过程可以产生更多的自由基，使反应加速，最终完成反应。包括引发、增长、终止三个阶段。(反应性足够强的起始自由基抽去脂质分子的氢原等一种或几种方式生成更多的脂质自由基，这种反应反复进行，即成为链式反应。终止：两个自由基3．脂质过氧化：即脂质的自动氧化，或者多不饱和脂肪酸的或脂质的氧化变质。(化剂或自由基清除剂可以抑制脂质过氧化的发生，常见的抗氧化剂：超氧化物歧化酶(superoxidedis-—23—包括甘油磷脂和鞘磷脂两类胺、丝氨酸、肌醇、甘油、磷脂磷脂酰甘油等极性头与磷酸连接。(磷脂酰胆碱(卵磷脂)，磷脂酰乙醇胺 (脑磷脂)等)2．甘油磷脂属于两亲分子，在水中能形成双分子微囊，可构成生物膜。用碱或酶可水解成脂肪酸、甘油和含氮碱，酶水解的一些中间物如溶血甘油磷脂是强表面活性剂，可使细胞膜溶解。—24—4．鞘磷脂：即鞘氨醇磷脂，在脑髓鞘和红细胞膜中含量丰富。由鞘氨醇、脂肪酸和磷脂酰胆碱组成。成6．鞘磷脂：即神经酰胺的1－位羟基被磷酰胆碱或磷酰乙醇胺酯化形成的化合物。被硫酸化的称硫酸鞘糖脂或硫苷脂；糖基含唾液酸的称唾液酸鞘糖脂，又称神经节苷脂，—25—有平伏状的。2．胆固醇可转化为雄激素、雌激素、糖皮质激素、盐皮质激素和维生素D。胆固醇在肝脏中可转浆脂蛋白的分类：各类血浆脂蛋白的组成如表所示．乳糜微粒由小肠上皮细胞合成，主要功能是从小肠转运三酰甘油、胆固醇及其它脂质到血浆和其他组织；VLDL在肝细胞的内质网中合成，主要功能是从肝脏运载内源性三酰甘油和胆固醇至各组织；LDL的主要功能是转运胆固醇至外围组织，并调节这些部位胆固醇的从头合成；HDL新生的前体形式在肝和小肠中合成，改型中吸收死细胞和其它脂蛋白，将胆固醇酯化后快速地转送到VLDL或LDL；血浆中LDL水平高而HDL水平低的个体容易患心血管疾病。1．生物膜由蛋白质和极性脂质组成，少量的碳水化合物也是糖蛋白或糖脂的一部分。2．所有生物膜拥有共同的基本特征：对多数极性分子或带电分子不通透，允许非极性分子通透；约5－8nm厚，横切电镜照片近似三层结构。脂类与水相共存时会迅速形成一种脂双分子层结构而避开水的作用，生物膜的厚度(电镜测定为5－8nm)是由3nm的脂双分子层和蛋白的厚度决定的，所有证据都支持生物膜由脂双分子层构成。—26—3．膜脂的多态性：膜流动的程度依赖于脂的组成及温度，低温下的运动相对较少，脂双分子层几乎呈晶态(类晶体、半晶体)排列；温度升到一定高度时，运动增加，膜由晶态向液态转变。(虽然脂双层结构的本身是稳定的，但单个的磷脂和固醇可在脂质平面内有很大的运动自由，它们的横向运动很快，几秒之内单个脂分子就可环绕红细胞的一周。)胞与细胞的相互作用l—27—生物膜中兼性的磷脂和固醇形成一个脂质双分子层，非极性部分相对构成双分子层的核心，极性的头部朝外；脂质双分子层结构中，球状蛋白以非正规间隔埋于其中；另一些蛋白则伸出(突出)膜的一面或另一面；还有一些蛋白跨越整个膜。蛋白质在脂双分子层中的方向是不对称的，表现为膜蛋白功能的不对称。脂质与蛋白质之间构成一个流动的镶嵌结构。7．生物膜的功能：内外屏障；物质交换、细胞间通讯；(生物膜的形成对于生物的物质贮存及细胞间的通讯起着关键作用。) (一)选择题1．关于油脂的化学性质的叙述错误的为()A．油脂的皂化值大时说明所含脂肪酸分子小；B．酸值低的油脂其质量也差；C．向油脂中加入抗氧化剂是为了除去分子氧；D中所含的羟基也多；E．氢化作用可防止油脂的酸败2．关于甘油磷脂的叙述错误的为()A．在pH7时卵磷脂和脑磷脂以兼性离子状态存在；B．用弱碱水解甘油磷脂可生成脂肪酸盐；C．甘油磷脂可用丙酮提取；D．将甘油磷脂置于水中，可形成微团结构；E．甘油磷脂与鞘磷脂的主要差别在于所含醇基不同3．神经节苷脂是一种()类型的物质)—28—5．生物膜的主要成分是脂和蛋白质，他们主要通过()键相连。6．脂双层是许多物质的通透屏障，能自由通透的极性物质是C．所有的极性物质7．肝脏合成的血浆脂蛋白主要有8．下列哪种功能不是细胞膜所具有的C．保护功能D．能量转换9．跨膜蛋白与膜脂在膜内结合部分的氨基酸残基A．大部分是酸性B．大部分是碱性C．大部分是疏水性D．大部分是糖基化蛋白是： (二)填空题1．血浆脂蛋白的脂质和蛋白质是以作用方式结合的3．膜蛋白跨膜区域有水性侧链的含量比较高，胶原蛋白中氨基酸残基含量较高。高5．神经节苷脂是一类含有—唾液酸的鞘糖脂 (三)判断题1．生物膜具有流动性，膜蛋白可以从脂双层的一层翻转到另一层。()2．物质从高浓度一侧通过膜运输到低浓度一侧的过程被称为被动运输。()3．生物膜是由极性脂和蛋白质通过非共价键形成的片状聚集体，膜脂和膜蛋白都可以自由地进行侧向扩散和翻转扩散。4．生物膜是由极性脂和蛋白质通过非共价键形成的片状聚集体，膜脂和膜蛋白都可以自由地进行侧向扩散和翻转扩散。()5．胰蛋白酶只断裂赖氨酸和酪氨酸残基参与形成的肽键()。6．各类生物膜的极性脂均为磷脂、糖脂和胆固醇。()7．脂肪酸的碳链愈长，脂肪酸的溶解度愈大8．自然界中的单不饱和脂肪酸的双键的位置一般在第9－10碳原子之间。9．生物膜的基本结构是以脂肪为主的脂双层结构。—29—10．水刻意透过脂双层膜，而质子却不能任意通透脂双层膜。 四)问答题1．生物膜受到机械破坏后，为什么会很快的自动进行自我封合？ (1)请简单解释磷脂中的脂肪酸结构与细胞膜的流动性有何关系？胆固醇的含量、结构与心血管疾病有何关系？ (2)细胞膜的主要功能是生物物质的转运，请问，主动转运有哪些特点？ (3)请简单解释细胞膜的不对成性。—30—第三章蛋白质生物化学第一讲氨基酸质中常见氨基酸的结构特点、分类方法，熟记20种氨基酸的结构特点，三字母符号和单字母符号，了解蛋白质中不常见的氨基酸和非蛋白质氨基酸的典型例子及其作用。公式计算氨基酸溶液中各种离子比例或浓度的能力。掌握用甲醛滴定法测定氨基酸含量的方法。3．掌握氨基酸α－氨基参加的各种反应及用途；α－羧基参加的各种反应及其用途；α－氨基和α－羧基共同参加的反应及其用途；熟悉R基参加的一些重要反应及其用途。4．掌握氨基酸的立体化学和旋光性，熟记芳香族氨基酸的最大紫外吸收峰，了解核磁共振在氨基酸结构研究中的作用。5．掌握用纸层析、离子交换层析、高效液相色谱(HPLC)分离和分析氨基酸的基本原理。氨基酸是蛋白质的构件分子蛋白质的水解产物是氨基酸，有酸水解、碱水解及酶解。其中1．常见的蛋白质氨基酸共二十种。2．按化学结构分为脂肪族、芳香族和杂环族三类。3．按R－基的极性分为非极性R－基氨基酸、不带电荷的极性R－基氨基酸、带正电荷的极性R－基氨基酸、带负电荷的极性R－基氨基酸四类。4．也可将氨基酸分为非极性脂肪族R－基氨基酸、非极性芳香族R－基氨基酸、不带电荷的极性R－基氨基酸、带正电荷的极性R－基氨基酸、带负电荷的极性R－基氨基酸五类。氨基酸的三字符号要记清楚。—31——32—1．氨基酸在晶体状态和水溶液中均以兼性离子形式存在。等电点的计算对于R基无解离基团的氨基酸：对于R基有解离基团的氨基酸：pI等于等电形式两侧的pK值之和的一半，以等电形式为中心，另一个pK值为第二级解离，可以忽略不计。—33—根据pH＝pKa＋log{[质子受体]／[质子供体]}小的pK值之和的一半。等电点的计算方法可以外推至其他的有机分子以及多肽等分子。滴定终点由12左右降到9左右，可以用酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠滴定。1．α－氨基和α－羧基共同参加的反应：与茚三酮的反应与环己二酮发生缩合反应，曾被用于氨基酸序列分析；色氨酸可被N－溴代琥珀酰亚胺氧化，生成有色化合物，可用于色氨酸定量测定；半胱氨酸可生成烷基衍生物，可用于巯基的保护；巯基可与重金属—34—生成盐，使蛋白质失活；巯基在空气中可被氧化，金属离子对此有催化作用；．胱氨酸的二硫键可被还原为两个巯基。也可以被过甲酸氧化成两个磺酸基。的光学活性和光谱性质，所有组成蛋白质的氨基酸都是D－氨基酸。氨基酸的光谱性质：芳香族氨基酸的紫外吸收光谱如图所示，这一性质可用于蛋白质的定量测定。六、氨基酸混合物的分析分离纸层析纸层析—35—纸层析的实质是分配层析—36—真题讲解1组成蛋白质的基本单位是：()2．关于氨基酸的说明哪个是不正确的()A．酪氨酸和苯丙氨酸都含有苯环；B丝氨酸都含有羟基；C．亮氨酸和缬氨酸都是分枝氨基酸；E．组氨酸和色氨酸都是杂环氨基酸3．下列那种氨基酸溶液不能引起偏振光的旋转？()4．属于亚氨基酸的是())1．组成蛋白质的20种氨基酸都有一个不对称性的α－碳原子，所以都有旋光性。nm3．亮氨酸的疏水性比丙氨酸强。4．组成蛋白质的氨基酸均是L－型氨基酸，除甘氨酸外都是左旋的。5．自由在很高或很低pH值时，氨基酸才主要以非离子化形式存在。6．溶液的pH可以影响氨基酸的等电点。1．组成蛋白质的氨基酸中含硫的氨基酸有和。能形成二硫键的氨基酸是。 。氨基酸有、、和；酸性氨基酸有和 和解离常数分别为：—37—氨基酸pK3(R基)问：(1)四种氨基酸的等电点分别是多少？(2)四种氨基酸在pH7的电场中如何移动？pHpH时，消3．组成蛋白质的20种氨基酸中，哪些是极性的，哪些是非极性的，哪一种不能参与形成真正的肽键？第二讲蛋白质通论知识要点1．熟记蛋白质分类的常用方法和蛋白质的生理功能。2．掌握肽键的结构特点和肽类的有关概念，熟悉肽类的物理和化学性质，具备计算短肽链等电点和净电荷量的能力。熟悉活性肽的种类和典型例子。3．熟悉多肽链氨基酸序列测定的基本方法。包括N－末端和C－末端分析的常用方法；二硫桥断裂的方法；氨基酸组成分析的方法；肽链部分分解的方法；肽段氨基酸序列的测定方法；肽段拼接的方法；确定二硫桥位置的方法。具备利用实验数据推测短肽链氨基酸序列的能力。4．熟悉同源蛋白质物种差异与生物进化的关系。5．熟悉肽链人工合成的基本方法。6．了解研究蛋白质空间结构的常用方法。7．掌握维持蛋白质三维结构的作用力。念，熟悉拉氏构象图。9．掌握蛋白质二级结构的含义，α－螺旋，β－折叠片、β－转角、β－凸起、无规卷曲等二级结构元件的结构特点，熟悉α－角蛋白、丝心蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白等纤维状蛋白的结构特点。10．掌握超二级结构和结构域的概念和主要的结构类型。11．掌握球状蛋白三级结构的特征。熟悉膜蛋白的结构特点。12．掌握蛋白质变性和复性的有关概念和蛋白质折叠的基本规律，了解预测蛋白质空间结构的基本方法。13．掌握蛋白质四级结构的含义，四级结构的主要特点，及四级缔合在结构和功能方面的优越性。—38—机制、熟悉常见的血红蛋白分子病。、ELISA、免疫印迹测定 Westernblot、单克隆抗体制备等免疫生化分析方法的基本步骤。熟悉肌肉收缩的分子机制。17．掌握蛋白质等电点的概念及等电点在蛋白质研究工作中的意义。18．熟悉测定蛋白质相对分子质量的常用方法，具备利用实验数据计算蛋白质相对分子质量的能力。力法、IES－PAGE双向电泳法等方法分离分析蛋白蛋的基本原理和基本步骤，熟悉测定蛋白质含量的常用方法。 (一)蛋白质的化学组成和分类完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为7类：清蛋白(溶于水)、球蛋白(溶于稀盐溶液)、谷蛋白 (溶于稀酸或稀碱)、醇溶蛋白(溶于70％－80％的乙醇)、组蛋白(溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀)、精蛋白(溶于水或稀酸，不溶于氨水)和硬蛋白(只能溶于强酸)。由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下7类：核3．按蛋白质的生物学功能分类 (1)催化功能生物体内的酶都是由蛋白质构成的，没有酶，生物体内的各种化学反应就无法正常进行。 (2)结构功能蛋白质可以作为生物体的结构成分。高等动物的胶原蛋白是主要的细胞外结构蛋白，占蛋白总内质网等膜系统都是由蛋白质与脂类组成的；动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的。 (3)运输功能脊椎动物的血红蛋白和无脊椎动物的血蓝蛋白起着运输氧气的作用；血液中的载脂蛋白可运输脂肪，转铁蛋白可转运铁；一些脂溶性激素的运输也需要蛋白，如甲状腺素要与甲状腺素结合球蛋白—39—结合才能在血液中运输。4)贮存功能某些蛋白质的作用是贮存氨基酸作为生物体的养料和胚胎或幼儿生长发育的原料。此类蛋白质包括蛋类中的卵清蛋白、奶类中的酪蛋白和小麦种子中的麦醇溶蛋白等。肝脏中的铁蛋白可将血液中多余的铁储存起来，供缺铁时使用。 (5)运动功能肌肉中的肌球蛋白和肌动蛋白是运动系统的必要成分，它们构象的改变引起肌肉的收缩，带动机体运动。细菌中的鞭毛蛋白有类似的作用，它的收缩引起鞭毛的摆动，从而使细菌在水中游动。 (6)防御功能高等动物的免疫反应是机体的一种防御机能，它主要也是通过蛋白质(抗体)来实现的。凝血与素等，也担负着防御和保护功能。 (7)调节功能某些激素、一切激素受体和许多其他调节因子都是蛋白质。 (8)感觉功能生物体对信息的识别与传递过程也离不开蛋白质。例如，感受味道需要味觉蛋白，视觉信息的传递要有视紫红质参与。视杆细胞中的视紫红质，只需1个光子即可被激发，产生视觉。 (9)遗传调控功能遗传信息的储存和表达都与蛋白质有关。DNA在在染色体中是缠绕在蛋白质(组蛋白)上的。有些蛋白质，如阻遏蛋白，与特定基因的表达有关。β－半乳糖苷酶基因的表达受到一种阻遏蛋白的抑制，当需要合成β－半乳糖苷酶时经过去阻遏作用才能表达。 (10)其他功能某些生物能合成有毒的蛋白质，用以攻击或自卫。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白质合成。 (二)蛋白质的形状和大小按蛋白质的形状和溶解度可将蛋白质分为：纤维状蛋白质、球状蛋白质和膜蛋白质。蛋白质的相对分子质量差别很大。—40— (三)蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质的结构复杂，可分为不同的结构层次：2．二级结构：多肽链借助氢键形成的有规则的局部结构，如α螺旋、β折叠等。3．三级结构：球状蛋白质在二级结构基础上，借助次级键形成的相对独立的完整结构。4．四级结构：具有三级结构的组成单位(亚基)之间的聚合方式。 (四)蛋白质功能的多样性蛋白质序列的多样性(P160)决定了其功能的多样性。如：20种氨基酸形成的二十肽(每种氨基酸只用1次)可以形成的异构体为：又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假定在肽链的任一位置，12种氨基酸出 (一)胀和胀键的结构—41—面内两个Cα多处于反式构型。 (二)肽的物理和化学性质肽的等电点计算需先分别判断各解离基团的带电荷情况，再统计净电荷的量(P166表4－6)。肽的化学反应与氨基酸类似，同时，由于肽键的存在，肽可以进行双缩脲反应。 (三)天然存在的活性肽3．活性肽特点：含异常肽键，生理活性强，的测定 (一)蛋白质测序的策略1．确定蛋白质的纯度在97％以上。2．测定多肽链的数目。3．拆分多肽链。4．分析每一条多肽链的氨基酸组成。5．鉴定多肽链的N—末端和C—末端氨基酸残基。6．用两种以上方法裂解多肽链成较小的肽段。7．测定各肽段的氨基酸序列。8．拼接各肽段成完整的多肽链。9．确定二硫键的位置。 C (1)二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法)：2，4－二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N－端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物(DNP)。在酸性条件下水解，得到黄色DNP－氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP－氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 (2)丹磺酰氯法：在碱性条件下，丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)可以与N－端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰－氨基酸。此法的优点是丹磺酰－氨基酸有很强的荧光吸收，检测灵敏度可以达到—42—考 (3)异硫氰酸苯酯(PITC)法：N末端氨基酸生成相应的PTH(苯乙内酰硫脲)—AA，并脱离肽链，可连续测定N末端氨基酸，广泛应用于肽链的的氨基酸序列测定。 (4)氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N－端逐个水解肽链，释放氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，可以确定蛋白质的N－末端残基。 (2)肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C－端氨基酸分离，C末端氨基酸可用纸层析鉴定。但精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。 (3)羧肽酶法。将蛋白质在pH8．0，30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。目前常AC常将二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用来测定C末端氨基酸外，还可以用来测定氨基酸的排列顺序。 (三)二硫桥的断裂—43— (四)氨基酸组成的分析氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。酸水解中，色氨酸破坏，丝氨酸苏氨酸酪氨酸部分破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺中的酰胺基被水解。碱水解很多氨基酸破坏，但色氨酸保存。 (五)多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化胰蛋白酶trypsin水解产物：以赖氨酸精氨酸的羧基为末端的肽—44—甲硫氨酸羧基参与的肽键 (六)肽段氨基酸序列的测定1．Edman化学降解法：利用PITC(异硫氰酸苯酯)特异的从肽链氨基末端逐次降解，并测定，获得肽段序列的方法。包括三步反应。用此原理已制成蛋白质序列分析仪。若每次循环的准确度为 —45—2．降解法：可用氨肽酶和羧肽酶，只能测出末端的几个氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。3．根据核苷酸序列推定法：分离mRNA，经反转录测定cDNA的核苷酸序列，再用遗传密码推定氨基酸序列。撞池被裂解成离子碎片，在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白质组学中应用广泛，但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。 (七)二硫桥位置的确定泳—46— (八)蛋白质序列数据库1．欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS－PROT有10多万条肽链的信息；2．美国国家生物医学基金会主持的PIR有近30万条肽链的信息，但多数由核酸信息翻译而来，有些未经严格检验。3．美国政府支持的GenBank和欧洲的EMBL有大量的基因序列信息，从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息。四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 (一)同源蛋白质—不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质有序列同源性，有保守区与非保守区域，利用同源蛋白质非保守区域氨基酸残基的变化可以分析物种的进化位置，绘制进化树。同源蛋白质有共同的进化起源，一些功能差异很大的蛋白质：如溶菌酶和α－乳清蛋白功能差异很大，但有序列同源性。蛋白质家族的形成可能有趋同进化和趋异进化两种机制。 (二)蛋白质氨基酸序列的局部断裂可以产生相应的生物活性如血液凝固过程cascadeamplification用称为级联放大作用。如某些激素如肾上腺素以10e－8—10e－5M的浓度到达靶细胞，几秒钟就可使糖原磷酸化酶的活性达最大值。其反应之迅速乃因激素与膜表面上的激素受体结合，激活腺苷酸环化酶迅速合—47—凝血酶作用去掉血纤蛋白上的部分小肽段，使得血纤蛋白之间的静电斥力降低，从而促进聚集。集机体中的纤溶酶：专一断裂血纤蛋白棒状链接区中的肽键。蛋白质的人工合成氨基和羧基的保护与活化，1965年，我国完成了牛胰岛素的全合成。 (一)研究蛋白质构象的方法X射线衍射法(获得电子密度图)，紫外差光谱(检测共轭基团在不同微环境中的吸收变化，推测其空间位置和蛋白构象)，荧光和荧光偏振，圆二色性(蛋白质上的手性分子与偏振光的作用推测其构 (二)稳定蛋白质三维结构的作用力氢键(方向性、饱和性)、范德华力(定向效应、诱导效应、分散效应)疏水作用(熵效应)、盐键、二硫键。多肽链中氨基酸残基的组成和排列顺序称为蛋白质的一级结构，连接一级结构的键是肽键。蛋白质的二级结构是指蛋白质主链原子的局部空间结构，并不涉及氨基酸残基侧链构象，二级结构的种类有α－螺旋、β－折叠、β－转角和无规卷曲。氢键是维系二级结构最主要的键。三级结构是指多肽链主链和侧链原子的空间排布。次级键维持其稳定，最主要的键是疏水键。四级结构是指两条以上具有三级结构的多肽链之间缔合在一起的结构。其中每条具有三级结构的多肽链称为亚基，一般具有四级结构的蛋白质才有生物学活性。维持其稳定的是次级键，如氢 (三)多肽主链折叠的空间限制酰胺平面—由于肽键是一个共振杂化体，所以肽键具部分双键性质，不能自由旋转，肽键上面二面角：酰胺平面之间的位置可以任意取向，可允许的φ和ψ值—48— α螺旋的结构多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0．肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每一个氨基酸残基的酰胺基团的－NH基与其后第四个氨基酸残基酰胺基团的－CO基形成氢键。蛋白质分子为右手α－螺旋。 (．影响α螺旋形成的因素：R基太小使键角自由度过大，带同种电荷的R基相互靠近，β碳原子上有分支均不利于形成α螺旋，含脯氨酸的肽段不能形成α螺旋。)—280—DNA：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。克隆化：获取同一拷贝的过程。应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质与载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。也限制性核酸内切酶·DNA聚合酶Ⅰ·逆转录酶·T4DNA连接酶·碱性磷酸酶·末端转移酶·TaqDNA聚合酶—281—，具有识别自身DNA或异源DNA的功能，通过切割破坏或限制异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。2)作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA识别特性：具有双链对称的回文结构3)命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。4)限制性修饰酶分为三类根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型 (TypeI)、第二型(TypeII)及第三型(TypeIII)。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。Ⅰ型，III型的切割位点是随机的，不特异。Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。基因工程中主要用的是Ⅱ型限制性内切酶，Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构(palindrome)5)作用特点：所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。—282—使用相同的粘性末端进行重组，会有较多的载体自身环化，或目的基因串联，目的基因的定向连接常使用两种限制酶，产生两种不同的粘性末端。可以在载体和目的基因的两端连接接头(引入限制酶切点)，或衔接物(含有粘性末端)，再连接载体和目的基因。因工程中，大肠杆菌连接酶只连接黏性末端，而T4连接酶既可连接黏性末端，又可连接平末端。大特点是热稳定(95℃以上高温半小时不失活)，最适反应温度高(70~75℃)。因此，其主要用途是PCR及DNA测序(具有二级结构的DNA)。—283—①5’→3’聚合酶活性。逆转录酶能以RNA或DNA为模板合成DNA分子，但是后者的合成很慢；末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)末端转移酶能在二价阳离子作用下，催化DNA的聚合作用，但不需要模板，将脱氧核糖核苷酸加脱氧核糖核酸酶IseIDNA生成具有5’－磷酸末端的寡核苷酸。作用特点：②降解单链DNA或RNA，但降解DNA的速度大于降解RNA的速度(7倍)；③降解方式为内切和外切，内切为主；用途：①切掉DNA片段的单链突出末端产生平头末端；②在双链cDNA合成时切除发夹环结构；③S1核酸酶作图分析。如内含子的数目、大小、位置分析及转录起始位点与终止位点分析等。1．定义：基因载体是把基因导入细胞的工具，他的作用是①运载目的基因进入宿主细胞，②使之能得到复制和进行表达。(携带目的基因、并实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。载体。 (1)能自主复制；(2)具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；(3)具有1~2个筛选标记；(4)克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入其他生物细胞；(5)易于操作，转化效率高。现用的载体都是通过改造构建而成的。主细胞的基本条件是：DNA力；易于生长和筛选；符合安全标准。克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特异设计的载体称为克隆载体。—284—考expressionvector插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特异设计的载体称为表达载体。载体的选择标准：能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点(外源DNA插入点)，常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞一些遗传性状。有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。pBR322共有24种限制性内切酶的单一识别位点，其中7 (ClaI，HindⅢ)的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。3种酶(scaI，PvuI，PstI)在氨苄青霉素抗性基因(am-pr)内具单一的识别位点，在这3个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。若将外源基因插入tetr基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌，则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。—285—6．噬菌体载体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组λ噬菌体DNA改造系统EMBL系列(置换型，适用基因组克隆) 从染色体DNA中分离人工合成基因文库超声波处理基因组DNA可得到300bp左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能—286—由机械处理产生的DNA片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少使用这种方法。NAⅡ型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。若载体DNA与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接。内切酶识别的DNA顺序长短与降解后DNA产生的片段大小有直接关系。若识别顺序为4个碱DNA的机率为44，即在碱基随机排列的前提下，每256个碱基对就有一个切点。对于识别6个核苷酸的限制性内切酶，其顺序出现的频率为46(4096)，可获得较大的DNA片真核生物基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比较困难。用mRNAA表达。除建立cDNA文库以外，对于一些高丰度表达、容易纯化的蛋白质，可以直接通过该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再分离该蛋白质的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆，从而直接获得该特定基因的克隆，这是用染色体DNA难以达到的克隆效果。随着体外合成DNA的技术日渐完善，合成DNA的长度不断加长。一些小分子生物活性多肽，可以通过人工合成编码顺序插入载体后，转化细菌进行表达。分子较大的基因，可以通过分段合成，然商业产品。5．聚合酶链反应(PCR)扩增特定基因片段对于有部分了解或完全清楚的基因，可以通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段，然后进行克隆操作。唯一的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚。—287—入宿主细胞：1．外源基因导入原核细胞的常用方法有：1)转染，即用冰冷的CaCl2处理后瞬间加热，将含有外源DNA的质粒导入感受态的宿主细胞。2)转化，即用噬菌体将外源DNA导入感受态的宿主细胞。3)电穿孔法，即用脉冲高压电瞬间击穿细胞膜，将含有外源DNA的质粒导入宿主细胞。4)λ噬菌体的体外包装，将含有外源DNA的λ噬菌体DNA与外壳蛋白在体外包装成噬菌体，可以大幅度提高转化率，包装蛋白有商品出售。外源基因导入酵母细胞的常用方法有：2．外源基因导入动物细胞的常用方法有：1)磷酸钙共沉淀法；2)DEAE－葡聚糖或聚阳离子促进吸收法；3)脂质体转染法；4)电穿孔法；5)病毒转染法；6)显微注射法。3．外源基因导入植物细胞的常用方法有：1)用纤维素酶消化细胞壁，制成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，促进重组DNA的吸收，也可使用电穿孔法和脂质体转染法。2)将外源DNA插入Ti质粒的T－DNA，借助土壤农杆菌将外源DNA导入植物细胞。3)基因枪微弹射击法。4)显微注射法。感受态细胞：细胞受理化因素等处理后，膜通透性发生变化，处于易于接受外源DNA的状态，称作感受态细胞。DNA重组体的筛选与鉴定1．根据重组载体的表型进行筛选3．利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定．直接选择法 (1)抗药性标记选择 (3)分子杂交法—288—原位杂交抗药性筛选法：重组DNA载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因时，通常可以取用转化体系涂布含该抗生素的选择培养平板的方法进