T-SPPHN 002-2024 十字花科蔬菜病毒病综合防控技术规程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofPreventionTechnologyoftheCruciferaeVegetableViralDiseases湖南省植物保护学会发布I本文件是根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由湖南省植物保护学会提出。本文件由湖南省植物保护学会归口。本文件起草单位为湖南省植物保护研究所、全国农业技术推广服务中心、山东省农业科学院植物保护研究所、云南农业大学、江苏省农业科学院植物保护研究所、中国农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：刘勇、张德咏、燕飞、张松柏、刘慧、李方方、史晓斌、李凡、吴元华、何自福、张卓、季英华。1十字花科蔬菜病毒病综合防控技术规程本标准规定了蔬菜十字花科病毒病的术语和定义、发生流行规律、病害诊断、防治原则、防治方法、统防统治、防控档案等技术要求。本标准适用于大白菜、萝卜、油菜、卷心菜等十字花科蔬菜病毒病的综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4285GB8321NY/T393农药安全使用标准农药合理使用准则绿色食品农药使用准则3术语和定义GB/T35333和界定的以及下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本标准。3.1综合防控技术Syntheticalpreventioncontroltechnology是在“预防为主、综合防治”的植保方针基础上，以确保农业生产、农产品质量和农业生态环境安全为目标，以减少农药使用为目的，优先采取生态调控、生物防治、物理防治和科学用药等资源节约型、环境友好型技术来控制农作物病虫害的植物保护措施。3.2十字花科蔬菜Cruciferaevegetables茄科蔬菜主要包括大白菜、萝卜、油菜、卷心菜等蔬菜。3.3病毒病virusdisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、专一性或广谱性等。植物病原病毒一般活体寄生，但某些病毒亦可在发病植株残体中长期存活；病毒在植物体内进行核酸（RNA或DNA）和蛋白外壳复制并组成新病毒粒子，粒子在植物维管束中迅速移动致使植物周身感染并发病。24发生流行规律十字花科蔬菜病毒病主要由芜菁花叶病毒（Turnipmosaicvirus，TuMV）引起、其次由黄瓜花叶病毒（Cumbermosaicvirus，CMV）和烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）等病毒引起。TuMV和CMV均可由蚜虫和汁液接触传染，而TMV主要是靠汁液接触传染。4.1接触传染病毒病流行规律病毒病由液汁接触和传毒害虫传播为主，整枝，打叉，搭架，采果等农事活动中，只要造成寄主微创口，即可侵入危害，病毒可在多种植物上越冬，病残体、带毒种子均可成为病毒病的初侵染源，此外，土壤瘠薄、黏重、板结、排水不良和偏施氮肥都会加重病情发展。4.2虫传病毒病流行规律在北方，十字花科蔬菜病毒病的毒源可在冬季十字花科蔬菜、棚室十字花科蔬菜和野生十字花科植物上越冬。冬季不种十字花科蔬菜的地区，病毒主要在窖藏的大白菜、甘蓝、萝卜留种株、田间宿根植物或越冬野菜上越冬。在南方，由于终年长有上述十字花科植物，则无明显越冬现象。感病的十字花科蔬菜、田间野生十字花科杂草都是重要初侵染源，春季通过有翅蚜虫迁飞传播扩散蔓延，全年均可发病，但以春、秋季节发病造成的损失最为严重，尤其是秋季，整个的病毒年侵染循环中，蚜虫起着非常重要的作用。5病害诊断5.1病害田间诊断大白菜病毒病在大白菜生长的幼苗期和成株期均可染病，但不同时期受侵染后，发病程度有所差异，侵染越早，发病越重。大白菜受病毒病侵染后会表现各种症状，幼苗期受害后，会出现沿叶脉褪绿，花叶及皱缩，有的有坏死斑，至成株期还可表现孤丁、抽风、不能包心、结球，叶片扭曲畸形、质脆、植株矮化（参见附录A）。萝卜感病后，多整株发病呈现各种症状（参见附录A），叶片出现叶色不均匀，深绿和浅绿相间，花叶，浓绿部分常突起呈疱状，皱缩，有时畸形，有的显现为淡绿色至黄绿色花叶，有的叶片扭曲、蕨叶，外围的老叶变黄，叶面皱缩变形，重病株矮化。油菜染病后，从心叶发病，产生沿叶脉两侧裉绿，叶片呈黄绿相间的花叶，明脉或叶脉呈半透明状，严重时叶片皱缩卷曲或畸形，花叶状皱缩，整株矮缩，老叶片上出现坏死斑（参见附录A）。5.2生物学检测用于生物学检测病毒的常用鉴别寄主植物有心叶烟、三生烟、本氏烟、苋色藜、矮牵牛等。采用摩擦接种的方法对病毒进行接种培养。具体方法和检测结果见附录B.1。5.3分子生物学检测3采用硅粒吸附法提取植物总RNA。以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录（RT），转录合成cDNA链，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒见附录B.3。6防治原则根据十字花科蔬菜病毒病和传毒害虫的发生规律及危害特点，本着“预防为主，综合防治”的指导思想，从农田生态系统整体出发，保护生物多样性，控制生产环境，减少病毒来源，具体以农业防治、物理防治、生物防治为主，选用抗病品种、种子脱毒、培育无毒种苗、清洁田园、减少田间寄主的存在等措施，降低病虫害暴发几率，积极保护利用自然天敌，恶化病虫的生存条件，提高农作物抗虫能力，尽量减少化学农药的使用，当农业防治、物理防治、生物防治防治病虫害无法控制在经济阀值以下时，辅以高效、低毒、低残留和低污染的农药，将病虫危害损失降到最低限度。7防治方法7.1种植抗病品种抗病品种是十字花科蔬菜病毒病防控的基础，各地应因地制宜选择适宜当地种植的优质、抗病、抗逆性强、商品性好的，且与栽培季节和栽培方式相适宜的优良品种。一般叶色深绿，帮色深绿的较白帮的抗病。7.2选种及种子消毒7.2.1选种无病株留种：选留采种株时，要严格挑选，在采种田淘汰病株，减少毒源，从无病优质的良种株上采集种子。7.2.2种子消毒先用清水浸泡种子3-4h，再放入10%磷酸三钠溶液中浸20-30min，捞出洗净后催芽；或将干种子放入70℃的恒温箱中，干热处理72h，经检查发芽率正常后备用。7.3农业防治7.3.1合理间、套、轮作尽量不与十字花科作物邻作，与早、中甘蓝地保持一定距离。选用空茬地或倒茬地，合理轮作，避免十字花科作物重茬栽培，实行2-3年的轮作。前茬以葱、蒜茬为好，因其含有相当数量的辛辣素，具一定杀菌或抑菌作用，可减少病害的发生，还可选择前茬种植豆类、瓜类等的田块。7.3.2适期播种不要播种过早，使幼苗期避开高温干旱气候，播种过早，正值高温干旱，不利于幼苗生长，植株抗病力弱利于病毒病的发生。47.3.3清洁田园，加强管理一茬白菜、萝卜或甘蓝等蔬菜收获后，很多病菌附着于残叶上，应彻底清除这些田间残枝败叶及残根，平常也应及时清除田间及周围的十字花科杂草。注意防病，及时拔除病株，接触过病株的手和工具，要及时用肥皂水或磷酸三钠水溶液冲洗。7.3.4水肥管理苗期不能缺水，“三水齐苗、五水定棵”，以小水勤灌为宜，即播后浇第1次水，幼苗出土时浇第2次水，幼苗出齐后浇第3次水，4-5片真叶时浇第4次水，7-8片真叶时浇第5次水，这样可促进壮苗，增强苗期抗逆性，同时又可防止地温升高，是防治病毒病的有效措施。如遇到雨天，还要及时排水防涝。要施足充分腐熟的优质有机肥、增施磷、钾肥，少量多次追施N肥、及时蹲苗，促进幼苗生长，增强植株抗病能力。7.4物理防治7.4.1银灰膜避虫根据蚜虫对银色的忌避性，在蚜虫发生期，苗床及菜田采用银色反光膜驱蚜。每亩（30~40）条。7.4.2色板诱杀利用蚜虫对黄色或绿色有较强趋性的特性，在田间放置30cm×40cm的诱虫黄板或绿板300块/hm2，减少菜苗上的蚜量。将黄板或绿板呈棋盘式均匀插置田间，黄板或绿板底部略高出植株顶端20cm左右，黄板或绿板粘满害虫后及时更换。7.5农药防治在上述措施无法控制在病毒病和传毒害虫经济阀值以下，且病毒病和传毒害虫出现大面积爆发时，采用农药防治。农药使用应符合国家绿色食品农药使用准则。7.5.1农药防治病毒病病毒病均以防为主，可在发病初期使用高效、低毒、低残留农药进行防治。注意，由于十字花科蔬菜生育期普遍较短，一般只有30-50天，因此采收之前7-10天，必须停止用药。防治病毒病常用药剂的用量及用法见附录C。7.5.2农药防治蚜虫当田间有虫率（5~15）%时开始用药，优先采用植物源农药，严禁使用禁毒农药或高毒农药，防治蚜虫常用药剂的用量及用法见附录C。8深化病虫测报，确保统防统治根据田间调查情况结合气象因素分析，及时对病虫害进行预测预报，当病虫害达到影响经济阀值时，当地政府应组织种植户对整片作物进行科学的病虫害防治。59建立防控档案在田间调查十字花科病毒病发生情况时，具体调查内容见附录D。6附录A（资料性附录）十字花科作物病毒病症状大白菜病毒病在大白菜生长的幼苗期和成株期均可染病，但不同时期受侵染后，发病程度有所差异，侵染越早，发病越重。大白菜受病毒病侵染后会表现各种症状，幼苗期受害后，会出现沿叶脉褪绿，花叶及皱缩，有的有坏死斑，至成株期还可表现孤丁、抽风、不能包心、结球，叶片扭曲畸形、质脆、植株矮化（参见附录A）。A1辣椒病毒病为害症状萝卜感病后，多整株发病呈现各种症状（参见附录A），叶片出现叶色不均匀，深绿和浅绿相间，花叶，浓绿部分常突起呈疱状，皱缩，有时畸形，有的显现为淡绿色至黄绿色花叶，有的叶片扭曲、蕨叶，外围的老叶变黄，叶面皱缩变形，重病株矮化。A2萝卜病毒病为害症状油菜染病后，从心叶发病，产生沿叶脉两侧裉绿，叶片呈黄绿相间的花叶，明脉或叶脉呈半透明状，严重时叶片皱缩卷曲或畸形，花叶状皱缩，整株矮缩，老叶片上出现坏死斑（参见附录A）。A3油菜病毒病为害症状7（规范性附录）病毒病检测方法B.1病毒生物学检测B.1.1病毒摩擦接种方法目撒到待接种叶的表面（也可直接将金刚砂加在研磨液中），在营养钵内插上标签，注明处理及时间；用手指或研棒、棉球和纱布蘸取少许汁液，在待接种叶面上轻轻均匀地涂擦，沿一个方向抹，一般沿从叶基到叶尖方向，涂擦时用另一只手指托住叶片，注意用手涂擦前需用肥皂洗净手指；用清水冲洗接过种的叶片，将植株放于温室（最好22~25℃)。用缓冲液接种植株作对照；接种后的纯化，将带毒叶片用接种缓冲液研磨后采用摩擦汁液接种的方法接种于枯斑寄主上，待枯斑寄主表现单斑后，将单个斑点剪下，用接种缓冲液研磨再次接种至枯斑寄主，出现单斑症状后再次取下单斑接种于枯斑寄主，出现斑点后再取单个斑点接种于系统寄主，出现系统症状后再取叶片进行保存和检测。B.1.2病毒的保存将经过三次单斑纯化后毒源，再次接种至系统寄主上，待其出现系统症状后，取发病叶片使用冷冻干燥的方法处理后，写明标签，存于-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接种至病毒敏感植物上，观察其症状(见图B1、图B2、图B3)。图B1CMV分离物接种至苋色藜上的症状（a）：枯斑；接种至心叶烟上的症状（b）：系统花叶。图B2TMV分离物接种至心叶烟上的症状（a）：枯斑；接种至三生烟上的症状（b）：系统花叶。8B.2分子生物学检测B.2.1GB溶液4.0M0.2M25mM1M2.5%（W/V）异硫氰酸胍NaAc（pH5.2）EDTA(pH8.0)KAcPVP-40B.2.210%NLS将1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。B.2.3WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaClB.2.4NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3B.2.5硅溶液将60g二氧化硅溶于500mL水中，静置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，静置5h，倒掉440mL上清，用HCl将剩下的60mL沉淀调pH值至2.0，高压灭菌后，200μL/管分装，-20℃保存。B.2.6模板RNA的制备采用硅粒吸附法提取植物总RNA。取病叶0.1g，加3mLGB溶液，研磨至匀浆；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃温育10min，不时上下颠倒混匀，冰上放置5min，13000rpm/min离心10min；取300μL上清，加150μL无水乙醇，300μLNaI，25μL硅溶液，混匀，温室下不停颠倒混匀10min；6000rpm/min离心1min，倒去上清；加500μL洗涤液（WB:无水乙醇=1:1）洗涤，6000rpm/min离心1min，倒掉上清，重复该步骤；沉淀加ddH2O150μL,70℃温育4min，1min后将离心管盖打开，随即盖上；13000rpm/min离心3min，取上清，-20℃保存。B.2.7RT-PCR扩增B.2.7.1反转录反转录试剂盒购自全式金，以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录（RT转录合成cDNA链具体反应体系及步骤见表B1。表B1病毒反转录体系试剂体积TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover总体积20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加热5min，-20℃保存。B.2.7.2反应引物TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物见表B2。表B2TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物病毒名称（前引/后引）引物序列片段长度TuMVTuMV-FTAAACGGAATGTGGGTGATGATGG333bpTuMV-RGTCCTCGGTCGTATGCCTTTCCCMVCMV-FATGGACAAATCTGRATCWMCC764bpCMV-RCTGGATGGACAACCCGTTCTMVTMV-FCGGTCAGTGCCGAACAAGAA690bpTMV-RATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT(K=G或T；W=A或T；V=A，C或G；S=G或C；Y=C或T；R=A或G；B=G，C或T)B.2.7.3反应体系TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR引物反应体系见表B3表B3CMV、TMV特异性RT-PCR引物反应体系试剂体积10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP前引后引酶0.3μLcDNA加水定容至20μLB.2.7.4反应程序TuMV、CMV、TMV的特异性RT-PCR反应程序见表B4表B4CMV、TMV的特异性RT-PCR反应程序病毒名称反应程序TuMVCMVTMVB.2.7.5琼脂糖凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳检测，取5µL扩增反应物与2mLSYBR