T-SHAAV 014-2024 动物病原微生物基因扩增实验室技术要求

ICS11.220B42SHAAV团体标准T/SHAAV014—2024动物病原微生物基因扩增实验室技术要求LaboratorytechnicalrequirementsforgeneamplificationofanimalpathogeniCmicroorganisms2024-04-10发布2024-04-10实施上海市畜牧兽医学会发布T/SHAAV0142024前言本文件按照GB/T1.12020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口。本文件起草单位:上海市动物疫病预防控制中心、上海市奉贤区生态养殖服务中心、上海市嘉定区农业技术推广服务中心、上海市松江区农产品质量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集团)有限公司。本文件主要起草人:鞠厚斌、杨德全、王建、李鑫、赵洪进、陈琦、盛文伟、吴文辉、陶军、金一春、李布社、庄根平、杨显超、王晓旭、葛菲菲、沈海潇、周锦萍、李凯航、曹向英、石慧花、葛杰、李晓婕、唐燕婷。本文件首批承诺执行单位名单:上海市动物疫病预防控制中心、上海市奉贤区生态养殖服务中心、上海市嘉定区农业技术推广服务中心、上海市松江区农产品质量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集团)有限公司。T/SHAAV0142024动物病原微生物基因扩增实验室技术要求本文件规定了动物病原微生物基因扩增实验室总体要求、质量保证和质量控制。本文件适用于动物病原微生物基因扩增实验室的布局设置及开展基因扩增检测活动。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T40974核酸样本质量评价方法CNAS-CLO1检测和校准实验室能力认可准则CNAS-CL01-A024检测和校准实验室能力认可准则在基因扩增检测领域的应用说明CNAS-GL029基因扩增领域检测实验室认可指南NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范JJF1815II级生物安全柜校准规范JJG646移液器检定规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。基因扩增geneamplification通过生物体外试验的方法为某一特定的基因的拷贝数选择性地增加而其它基因并未按比例增加的过程(不包括自然基因扩增),即以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术。[来源:CNAS-CL01-A024,3]聚合酶链反应polymerasechainreaction,PCR体外扩增DNA的酶促反应过程。[来源:SNiT2102.12008,3.4.1]反转录聚合酶链反应reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR包括RNA反转录为DNA和PCR扩增两步反应。[来源:SNiT2102.12008,3.4.23.42T/SHAAV0142024实时荧光PCRreal-timePCR通过在PCR反应体系中加入荧光标记探针,利用荧光信号累积实现对PCR扩增效率、扩增情况及数据进行实时监控的PCR方法。[来源:农业部2259号公告4215,2.7]4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)EB:溴化乙锭(Ethidiumbromide)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)GITC:异硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)5动物病原微生物基因扩增实验室的分区要求5.1.1设施和环境要求动物病原微生物基因扩增实验室设计和布局应符合相关法律法规的要求,设施与环境应符合GB19489、GB/T27025、CNAS-CLO1、CNAS-CL01-A024和CNAS-GL029中的规定。动物病原微生物基因扩增实验室,总体布局和各部位的安排应减少潜在的对样本的污染和对人员的危害,原则上应设分隔开的工作区域,包括(但不限于):试剂配制与贮存区、核酸提取区、核酸扩增区和扩增产物分析区。有条件的宜在所分隔的各工作区域设置缓冲间,缓冲间的压力为负压,与其相连的工作间为正压,工作间与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置。未设置缓冲间的工作区域的压力设计一般遵循试剂配制与贮存区为正压,其它三个工作区域为负压或减压的原则。根据仪器设备的配置及功能,区域可适当合并。如使用荧光定量PCR仪时,核酸扩增区、扩增产物分析区可进行合并;采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则核酸提取区、核酸扩增区、扩增产物分析区可进行合并。不同功能的工作区域应是分隔独立的工作室,并有明显的标志,各区间不能直通,各区之间如果是紧密相连,需安装物品传递舱。动物病原微生物基因扩增实验室的空气流向可按照试剂配制与贮存区核酸提取区→核酸扩增区→扩增产物分析区进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂配制与贮存区核酸提取区→核酸扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可安装排风扇,负压排风扇装置和其它可行的方式实现。5.2实验室工作区域的设置及要求用于试剂的配制和贮存(包括商业化的试剂),所有试剂的配制与分装。压力可设置为正压。5.2.2核酸提取区用于样本的前处理,核酸的提取、纯化与贮存,核酸提取质量检查等。样本前处理所用器皿应经过彻底清洗和高压消毒处理,并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染,否则不可重复使用。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。应防范病原微生物外泄和污染人员,保护样本不被污染,应配备II级生物安全柜。压力可设置为常压或负压,可安装排风系统。3T/SHAAV01420245.2.3核酸扩增区用于扩增反应体系的配制和模板的加入,核酸扩增。在巢式PCR测定中,第一轮扩增后需打开反应管,第二次加样必须在本区内进行。压力可设置为负压,可按-20pa(缓冲间为常压)设置,可安装排风系统。5.2.4扩增产物分析区用于扩增产物的检测和确认。压力可设置为负压,可安装排风系统。5.3工作基本原则5.3.1进入各工作区域应严格按照单一方向进行,即试剂配制与贮存区核酸提取区→核酸扩增区产物分析区。5.3.2各工作区域应有明确的标识,不同工作区域内的设备、物品不得混用。5.3.3在不同的工作区域应使用有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。5.3.4实验室的清洁应按试剂配制与贮存区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具,不得混用,以防止交叉污染。5.3.5工作者在整个实验操作过程中应戴口罩和手套,并及时更换。5.3.6在操作过程中应正确使用移液器,避免在移液操作中产生气溶胶污染。5.3.7在样本前处理、核酸提取等过程中出现实验材料散落或PCR产物外溅时,应立即进行清洁处理并作出记录。5.3.8实验结束后,应立即对工作区域进行清洁。实验台面、超净工作台宜用3%双氧水或10%次氯酸钠溶液(含有效氯1gL)擦拭清洁;也可在擦拭后再用紫外线照射,照射距离应不超过90cm,照射时间宜过夜。注:3%双氧水和10%次氯酸钠在使用前配制,配制好的溶液不宜长期存放。5.3.9实验室及其设备的使用应做好日常记录。5.4安全防护工作者在整个实验操作过程中应戴手套、口罩、帽子,且应根据病原微生物的类别,佩戴防护眼镜、穿防护服或采取其他安全有效措施,应按照GB19489中的规定执行。5.5废物处置5.5.1感染性材料所有感染性材料应在实验室内通过高压灭菌等方式清除污染再进行处置,按照GB19489中的规定执行。5.5.2移液器吸头使用过的移液器吸头应放入含有10%次氯酸钠溶液的容器内浸泡,浸泡时间不宜少于24h。5.5.3PCR产物和阳性质粒含有PCR产物的所有液体及废弃物和阳性质粒应放入含有1mol/L盐酸(HCL)的容器中浸泡,浸泡时间不少于6h5.5.4琼脂糖凝胶及电泳液对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理按照GB/T19495.2中的规定执行。6质量保证6.1.1样本的采集按NY/T541执行。用于基因扩增检测的样本包括内脏组织,抗凝全血、血清,粪、尿及分泌物等。进行静脉采血时,宜使用专用的一次性安全真空采血器。进行脏组织、粪、尿、分泌物4T/SHAAV0142024等的采样时,应注意防止交叉污染。6.1.2在某一疫病的病程中,样本采集过早或过迟都会导致假阳性或假阴性结果,应注意样本采集时限性或时效性。6.1.3样本的采集材料(如拭子)或试剂(如抗凝剂、防腐剂或其他常规添加剂)应不干扰扩增或检测过程,抗凝剂应选取EDTA或构橼酸盐。6.1.4全血样本应进行抗凝处理,采血后,应在3h内分离血浆。6.1.5无需抗凝处理的血液样本,采血后,应在1h内分离血清,以避免RNA的降解。6.2样本的稳定化处理6.2.1用于DNA扩增检测的样本,不需稳定化处理,应在采集后冷藏条件下及时送至实验室。6.2.2用于RNA扩增检测的样本,需稳定化处理,应在采集样本时,将样本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/LGrTC的试管中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。6.3样本的运送样本采集后应尽快送至实验室进行检测,运输过程中,特别是在需要保持细胞的完整性时,应注意避免样本的过冷或过热,并尽量减少细菌等污染物的生长,而且应保证样本中的靶核酸免受内源性或外源性核酸酶的破坏与降解。6.4样本的贮存6.4.1采集的临床样本可于-70℃以下长时间贮存。6.4.2用于PCR测定的DNA靶核酸样本应在10mmol/LTris-1mmolLEDTA缓冲液(PH7.5~8.0)中4℃保存。6.4.3用于PCR测定的RNA靶核酸样本应在一定缓冲液中-80℃或液氮中贮存。6.4.4用乙醇或异丙醇等沉淀的靶核酸样本贮存在-20℃即可。6.4.5用GITC处理的RNA样本可在室温保存7d。6.5样本的处理6.5.1样本的处理应尽量简化,以减少样本的交叉污染或丢失靶核酸的机会。6.5.2待扩增的靶核酸可能来源于不同的临床样品,如血液、体液、粪便、组织等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。应根据靶核酸不同的存在状态,采取相应的处理方法,选取相应的商品化核酸提取试剂盒。6.5.3核酸样本的浓度、纯度和完整性的质量评价方法见GBT40974。6.6逆转录CDNA合成为逆转录PCR中的第一个酶反应步骤,应避免逆转录效率的降低或完全缺乏;样本中避免存在逆转录或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血红素等)及RNA酶的存在。6.7核酸扩增多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果,如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不当、Mg2+浓度不佳、样本或试剂受污染等。6.8扩增产物的分析6.8.1扩增产物的分析方法有多种,如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。扩增产物是主要的污染来源,应避免通过物品及工作服将扩增产物带出。6.8.2使用过的移液器吸头、PCR产物和含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液分别按本文件中5.5.2、5.5.3和5.5.4中规定处理。6.8.3在用到某些可致基因突变和有毒物质如EB、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,应注意工作人员的安全防护。5T/SHAAV01420246.9污染的分析与处理检测过程中对污染的预防和处理原则,防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执