酶工程3 动、植物细胞培养产酶

关于酶工程3动、植物细胞培养产酶动物细胞获得：离心分离技术、杂交瘤技术、胰蛋白酶消化处理技术等培养方式：悬浮培养、贴壁培养和微载体培养等植物细胞获得：机械捣碎、酶解和诱导愈伤组织的方法培养方式：固体培养、液体浅层培养、液体悬浮培养等,在次级代谢物的生产过程中通常采用液体悬浮培养。第2页,共42页，星期六，2024年，5月第一节植物细胞培养产酶植物是各种色素、药物、香精和酶等天然产物的主要来源：

目前已知的天然化合物超过30000种,其中80%以上来自于植物;从植物中得到的最普遍又必不可缺的药物有17类,我国普遍使用的中草药及其制剂80%以上来源于植物,美国每年使用的植物来源的药物超过30亿美元;全世界每年使用的植物来源的芳香化合物的价值超过15亿美元。第3页,共42页，星期六，2024年，5月研发历史1902年,哈勃兰德(Haberlandt)首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株的设想,100年来,随着培养基的研制和培养技术的发展,已经从200多种植物中分离出细胞,不仅可以通过细胞的再分化生成完整的植株,而且可以通过细胞培养,获得400多种人们所需的各种物质。第4页,共42页，星期六，2024年，5月20世纪80年代以后，植物细胞培养技术迅速发展,已成为生物工程研究开发的新热点。第5页,共42页，星期六，2024年，5月主要内容1.植物细胞的特点2.植物细胞培养的特点3.植物细胞培养的工艺条件及其控制植物细胞培养的工艺流程植物细胞培养的培养基4.植物细胞培养产酶的工艺过程第6页,共42页，星期六，2024年，5月一、植物细胞的特点第7页,共42页，星期六，2024年，5月植物细胞结构第8页,共42页，星期六，2024年，5月动物细胞模式图第9页,共42页，星期六，2024年，5月

植物、动物、微生物细胞的特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um200～3001～1010～100倍增时间/h﹥120.3-6﹥15营养要求简单简单复杂光照要求大多数要求不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感非常敏感主要产物色素、药物、香精、酶等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、单克隆抗体、多肽药、酶等第10页,共42页，星期六，2024年，5月三者之间的差异主要有：植物细胞>动物细胞>微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。第11页,共42页，星期六，2024年，5月二、植物细胞培养的特点植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞,再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得优良的植物细胞。然后,在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养,从而获得各种所需的产物。第12页,共42页，星期六，2024年，5月植物细胞培养生产各种天然产物,与从植物中提取分离这些物质相比,具有如下显著特点。1.提高产率2.缩短周期

植物细胞生长的倍增时间一般为12～60h,一般生产周期15～30天。3.易于管理,减轻劳动强度

不受地理环境和气候条件等的影响。4.提高产品质量

主要产物的产率较高,杂质较少；减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀；产物易于分离纯化。5.其他对剪切力敏感、生产周期长等缺点；许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。第13页,共42页，星期六，2024年，5月三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（一）植物细胞培养的工艺流程一般为：

外植体-----细胞的获取-----细胞培养-----分离纯化-----产物

第14页,共42页，星期六，2024年，5月1.外植体的选择与处理外植体：指从植株取出,经过预处理后,用于植物组织和细胞培养的植物组织(包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等)片段或小块。选择：首先要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株,如果植物细胞是用于生产次级代谢物,则需从产生该次级代谢物的组织部位中切取一部分组织,经过清洗,除去表面的灰尘污物。操作：将上述外植体切成0.5～1cm左右的片段或小块,用70%～75%乙醇溶液或者5%次氯酸钠、10%漂白粉、0.1%升汞溶液等进行消毒处理,再用无菌水充分漂洗,以除去残留的消毒剂。第15页,共42页，星期六，2024年，5月2.植物细胞的获取直接分离法,愈伤组织诱导法原生质体再生法第16页,共42页，星期六，2024年，5月直接分离法:

植物细胞可以直接从外植体中分离得到。分为机械法和酶解法两种。1）机械捣碎法分离植物细胞是先将叶片等外植体轻轻捣碎,然后通过过滤和离心分离细胞。优点:获得的植物细胞没有经过酶的作用,不会受到伤害;不需要经过质壁分离,有利于进行生理和生化研究。缺陷：由于受到机械的作用,细胞结构会受到一定的伤害,获得完整的细胞团或细胞数量少,其使用不普遍。2）酶解法分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体,分离出具有代谢活性的细胞。该法不仅能降解中胶层,而且还能软化细胞壁。所以用酶解法分离细胞的时候,必须对细胞给予渗透压保护,如甘露醇等。第17页,共42页，星期六，2024年，5月愈伤组织诱导法愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程:

将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入0.7%～0.8%的琼脂,制成半固体的愈伤组织诱导培养基。灭菌、冷却后,将上述外植体植入诱导培养基中,于25℃左右培养一段时间,即从外植体的切口部位长出小细胞团,此细胞团称之为愈伤组织。一般培养1～3周后,将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养,以获得更多的愈伤组织。第18页,共42页，星期六，2024年，5月原生质体再生法原生质体再生法:

原生质体(protoplast)是除去细胞壁后得到的微球体。植物原生质体的获得：可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。分离方法：机械分离法和酶解法两种,一般都采用酶解法。酶解法：植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。为使细胞壁降解释放原生质体,必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂,最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。在原生质体制备过程中,为了防止原生质体被破坏,一般要采用用高渗溶液,以利于完整原生质体的释放。配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。原生质体分离后,经过计数和适当稀释,在一定条件下进行原生质体培养,使细胞壁再生,而形成单细胞悬浮液。细胞壁再生后得到的植物单细胞,经过单细胞培养,长成细胞团,再经过继代培养,形成由原生质体形成的细胞系。第19页,共42页，星期六，2024年，5月3.细胞悬浮培养

将上述获得的植物细胞在无菌条件下,转入新的液体培养基,在人工控制条件的生物反应器中,进行细胞悬浮培养,获得所需的产物。4.分离纯化

细胞培养完成后,分离收集细胞或者培养液,再采用各种生化技术,从细胞或者培养液中将各种物质分离,得到所需的产物。第20页,共42页，星期六，2024年，5月水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织外植体愈伤组织第21页,共42页，星期六，2024年，5月（二）植物细胞培养的培养基1.培养基特点(1)

植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐:P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素（102～3×103mg/L）；Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素（10-2～30mg/L）。(2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素:如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。培养液中维生素的浓度一般为0.1～100mg/L(表2-9);而植物生长激素的浓度一般为0.1～10mg/L,(3)植物细胞要求的氮源一般为无机氮源:即可以同化硝酸盐和铵盐。(4)植物细胞一般以蔗糖为碳源:蔗糖的浓度一般为2%～5%。

第22页,共42页，星期六，2024年，5月2.几种常用的植物细胞培养基MS培养基（LS和RM培养基）

B5培养基

White培养基

KM-8P培养基应用最广的是MS培养基和LS培养基

MS培养基是1962年由Murashinge和Skoog为烟草细胞培养而设计的培养基。LS、RM培养基是在其基础上演变而来的。第23页,共42页，星期六，2024年，5月3.植物细胞培养基的配制将各种组分分成大量元素液、微量元素液、维生素溶液和植物激素溶液等几个大类,先配制成10倍或者100倍浓度的母液,放在冰箱保存备用。在使用时,吸取一定体积的各类母液,按照比例混合、稀释,制备所需的培养基。第24页,共42页，星期六，2024年，5月(三)温度的控制植物细胞培养的温度一般控制在室温范围(25℃左右)。温度高些,对植物细胞的生长有利,温度低些,则对次级代谢物的积累有利。但是通常不能低于20℃,也不要高于35℃。有些植物细胞的最适生长温度和最适产酶温度有所不同,要在不同的阶段控制不同的温度。第25页,共42页，星期六，2024年，5月(四)pH值的控制

植物细胞的pH值一般控制在微酸性范围,即pH5.0～6.0。培养基配制时,pH值一般控制在5.5～5.8范围,在植物细胞培养过程中,一般pH值变化不大。第26页,共42页，星期六，2024年，5月(五)溶解氧的调节控制植物细胞的生长和产酶需要吸收一定的溶解氧。溶解氧一般通过通风和搅拌来供给。

适当的通风、搅拌还可以使植物细胞不至于凝集成较大的细胞团,以使细胞分散,分布均匀,有利于细胞的生长和新陈代谢。然而,由于植物细胞代谢较慢,需氧量不多,过量的氧反而会带来不良影响。加上植物细胞体积大、较脆弱、对剪切力敏感,所以通风和搅拌不能太强烈,以免破坏细胞。这在植物细胞反应器的设计和实际操作中,都要予以充分注意。第27页,共42页，星期六，2024年，5月(六)光照的控制大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定波长的光的照射,并对光照强度和光照时间有一定的要求,而有些植物次级代谢物的生物合成却受到光的抑制。在植物细胞培养过程中,应当根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同,进行光照的调节控制第28页,共42页，星期六，2024年，5月(七)前体的添加前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量,在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。第29页,共42页，星期六，2024年，5月(八)刺激剂的应用刺激剂(elecitor)可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行,从而强化次级代谢物的生物合成,提高某些次级代谢物的产率。所以在植物细胞培养过程中添加适当的刺激剂可以显著提高某些次级代谢物的产量。常用的刺激剂：

微生物细胞壁碎片和果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。第30页,共42页，星期六，2024年，5月四、植物细胞培养产酶的工艺过程

以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导

选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。第31页,共42页，星期六，2024年，5月(2)大蒜悬浮细胞培养

将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（苄基腺嘌呤）的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。第32页,共42页，星期六，2024年，5月(3)酶的分离纯化

细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶(SOD)

：

是催化超氧负离子进行氧化还原反应的氧化还原酶,具有抗辐射、抗氧化、抗衰老的功效。SOD可以从动物、植物和微生物细胞中提取分离得到。第33页,共42页，星期六，2024年，5月第二节动物细胞培养产酶动物细胞培养是在20世纪50年代,伊尔勒(Earle)等人开始进行病毒疫苗细胞培养的基础上,于20世纪60年代迅速发展起来的技术。1967年开发的适合动物细胞贴壁培养的微载体技术,1975年发明的杂交瘤技术,有力地推动了动物细胞培养技术的发展。已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用,工业化生产达到20000L甚至更大的规模,已经成为生物工程研究开发的重要领域。第34页,共42页，星期六，2024年，5月1.动物细胞的特性(1)在于没有细胞壁(2)动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍,稍小于植物细胞的体积。(3)大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在,在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。(4)动物细胞的营养要求较复杂,必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养基中一般需要加进5%～10%的血清。第35页,共42页，星期六，2024年，5月

2.动物细胞培养的特点主要用于各种功能蛋白质的生产。细胞生长速度慢。（需添加抗生素）细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵。大多数细胞具有锚地依赖性，宜贴壁培养；部分细胞可采用悬浮培养。动物细胞培养基成分较复杂,一般要添加血清或其代用品,产物的分离纯化过程较繁杂,成本较高。原代细胞一般繁殖50代。第36页,共42页，星期六，2024年，5月3.培养方法

(1)悬浮培养来自血液、淋巴组织的细胞,肿瘤细胞和杂交瘤细胞(2)贴壁培养存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞（成纤维细胞、上皮细胞等）；采用滚瓶培养系统、微载体系统。(3)固定化细胞培养（锚地依赖性和非锚地依赖性细胞；吸附法和包埋法）第37页,共42页，星期六，2024年，5月4.培养基的组成与配置

动物细胞培养基的组分较为复杂,包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。

首先配制各类母液,如100倍浓度氨基酸母液、1000倍浓度维生素母液、100倍浓度葡萄糖母液(溶解于平衡盐溶液)等;在使用前,分别吸取一定体积的母液,混匀得到混合母液,膜过滤除菌后,冷冻备用;使用时,取一定体积的混合母液,用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。第38页,共42页，星期六，2024年，5月

5.培养条件的影响与控制（1）温度：一般控制在36.5℃，波动范围0.25℃.（2）pH值：一般控制在pH7.0-7.6的微碱性范围内（最优