(高清版)GBT 18648-2020 非洲猪瘟诊断技术

ICS11.220代替GB/T18648—2002DiagnostictechniquesforAfricanswinefever国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I V 12规范性引用文件 1 14生物安全措施 1 15.1易感动物和宿主 15.2临床表现 25.3病理变化 25.4临床诊断结果判定 26实验室诊断样品采集及处理 26.1试剂 26.2采样用具 26.3样品采集 26.4样品处理 37普通PCR方法 37.1试剂 37.2仪器设备 37.3引物序列 47.4试验程序 47.5试验成立条件 47.6普通PCR结果判定 58荧光PCR方法 58.1试剂 58.2仪器设备 5 58.4试验程序 5 6 6 69.1试剂 69.2仪器设备 69.3引物 6ⅡGB/T18648—20209.4试验程序 69.5试验成立条件 79.6荧光RAA结果判定 7 710.1试剂 710.2仪器设备 710.3试验程序 810.4高敏荧光免疫分析结果判定 8 911.1试剂 911.2仪器设备 911.3试验程序 911.4试验成立条件 12间接ELISA抗体检测方法 12.2仪器设备 12.3试验程序 12.4试验成立条件 13阻断ELISA抗体检测方法 13.2仪器设备 13.3试验程序 13.4阻断率计算方法 13.5试验成立条件 14夹心ELISA抗体检测方法 14.2仪器设备 14.3试验程序 14.4试验成立条件 15.2仪器设备 15.3试验程序 Ⅲ15.4试验成立条件 15.5间接免疫荧光结果判定 附录A(规范性附录)样品保存液的配制方法 附录B(规范性附录)聚合酶链式反应溶液的配制方法 附录C(规范性附录)酶联免疫吸附试验溶液的配制方法 VGB/T18648—2020本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替GB/T18648—2002《非洲猪瘟诊断技术》,与GB/T18648—2002相比，除编辑性修改 曾加了缩略语(见第3章):-——增加了生物安全措施(见第4章); 增加了临床诊断(见第5章);———增加了实验室诊断样品采集及处理(见第6章);———增加了荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方法(见第9章)、高敏荧光免疫分析法(见第10章)、夹心ELISA抗原检测方法(见第11章)、阻断ELISA抗体检测方法(见第13章)、夹心ELISA抗体检测方法(见第14章)、间接免疫荧光方法(见第15章)等实验室诊断方法；——增加了综合判定(见第16章);---—增加了样品保存液的配制方法(见附录A)、聚合酶链式反应溶液的配制方法(见附录B);——修改了酶联免疫吸附试验溶液的配制方法(见附录C,2002年版的附录C)。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-——GB/T18648—2002。1GB/T18648—2020非洲猪瘟诊断技术本标准规定了ASF的临床诊断，实验室诊断样品采集及处理，以及普通PCR方法、荧光PCR方本标准适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB19489实验室生物安全通用要求下列缩略语适用于本文件。ASFV:非洲猪瘟病毒(AfricanSwineFeverVirus)DEPC:焦碳酸二乙酯(DiethyPyrocarbonate)EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid)ELISA:酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)FAM:6-羧基荧光素(6-Carboxy-Fluorescein)OD:光密度(OpticalDensity)PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)RAA:重组酶介导的等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification)SPF:无特定病原体(SpecificPathogenFree)4生物安全措施猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感，且表现出相似的临床症状和2GB/T18648—2020病毒的储存宿主。5.2临床表现呼吸困难，病程延长则出现瘫痪、抽搐等其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100%。病程4d～10d。5.2.3亚急性：临床症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低。体温波动无规律，一般高于40.5℃。仔猪病死率较高。病程5d～30d。死亡率低。病程2个月到15个月。5.3病理变化典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血，肾脏、肺脏表面有出血点，心内膜和心外膜有大量出血巴结肿大，严重出血。最急性型的个体可能不出现明显的病理变化。5.4临床诊断结果判定易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似ASF病例。6实验室诊断样品采集及处理6.1试剂6.1.10.1mol/LPBS(pH7.4),配制方法见附录A的A.1。6.1.20.04mol/LPBS(pH7.4),配制方法见A.2。6.1.350%甘油-PBS保存液，配制方法见A.3。6.1.4青霉素，浓度为10000IU/mL。6.2采样用具6.3样品采集采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口GB/T18648—2020在发病猪群中，使用真空采血管(含EDTA抗凝剂)采集一定数量发病猪、同群猪全血各5mL,密封后冷藏或冷冻保存。将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入终浓度为1000IU/mL的青霉素、制备10%组织匀浆液。2000r/min离心处理7普通PCR方法7.1.1DNA提取试剂盒。7.1.2PCR预混液(2×):TaqDNA聚合酶(0.05U/μL),反应缓冲液，4mmol/LMgCl₂以及7.1.52%的琼脂糖凝胶，配制方法见B.4。34GB/T18648—20207.2.2PCR扩增仪。7.2.3台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)。7.2.4稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。7.2.5凝胶成像仪(或紫外透射仪)。7.2.7无核酸酶离心管与吸头。7.2.8PCR扩增管。引物针对ASFVB646L基因的保守区域设计。上游引物PPA-1:5'-AGTTATGGGAAAC-CCGACCC-3';下游引物PPA-2:5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3'。扩增产物大小为257bp。采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于-20℃冰箱保存。每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本(血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液);阴性对照样品应为无核酸酶水或者ASFV核酸阴性无核酸酶水7.5μLPCR预混液(2×)12.5μLPPA-2(10μmol/L)将22μLPCR反应混合液加入每个0.2mLPCR扩增管；将3μLDNA每次进行普通PCR扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作95℃预变性10min;95℃变性15s,62℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；72℃终延伸将5pL的6×上样缓冲液加入PCR产物中，混匀后取8μL加入到使用1×TAE缓冲液配制的58.1.3荧光PCR预混液(2×)。8.2.1荧光PCR扩增仪。8.2.2台式低温高速离心机(最大离心力1引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F1:5'-GCTTTCAGGAT-AGAGATACAGCTCT-3';下游引物VP72-R1:5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3';VP72-F1(10μmol/L)VP72-T1(10μmol/L)6GB/T18648—202050℃孵育2min;95℃预变性5min;95℃变性15s,58℃退火延伸1min,45个循环，在每一循环的58℃时收集FAM荧光信号。8.5试验成立条件阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值≥40且无特异符合8.5的条件，被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，则判为ASFV核酸阳性；当无Ct值或Ct值≥40,则判为ASFV核酸阴性；当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线，则判为疑似。对疑似样品，模板量加倍(4μLDNA模板)进行1次复检，做3个重复；有2个重复Ct值<40且出现特异性扩9荧光RAA方法9.1.3RAA反应预混液。9.1.5280mmol/L乙酸镁。9.2仪器设备9.2.1恒温荧光基因检测仪。9.2.2台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)。9.2.4无核酸酶离心管与吸头。引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F2:5'-TAGTGATAGAC-CCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3';下游引物VP72-R2:5'-CGATGATCCGGGTGCGATGAT-GATTACCTT-3';探针VP72-T2:GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTAT(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG。7GB/T18648—2020RAA预混液37.7μLVP72-F2(10μmol/L)2.1μLVP72-R2(10μmol/L)2.1μLVP72-T2(10μmol/L)0.6μL对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为扩增温度39℃,扩增时间15min,每隔20s收集荧光信号。9.5试验成立条件阳性对照起峰时间≤1.67min且出现特异性起峰曲线，阴性对照无起峰时间或阴性对照起峰时9.6荧光RAA结果判定检样品无起峰时间或被检样品起峰时间>10min且无特异性起峰曲线，则判定为ASFV核酸阴性。10高敏荧光免疫分析法10.2.4台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上)。8GB/T18648—202010.3试验程序取猪组织(优先采集脾或淋巴结组织)4g加入匀浆机，加入1mL0.1mol/LPBS(pH7.4)缓冲液，待检样本和检测卡从2℃~8℃取出，平衡到室温(25℃左右);高敏荧光分析仪开机。用微量可调移液器吸取样本40μL加入检测卡，然后加入50μL稀释液，从加样开始静置免疫反应15min后读值。用微量可调移液器吸取样本50μL加入检测卡，5min后加入50μL稀释液，接着再加入50μL稀释液冲洗。从加样开始静置免疫反应15min后读值。用微量可调移液器吸取样本40pL加入检测卡，然后加入50μL稀释液，从加样开始静置免疫反应15min后读值。10.4高敏荧光免疫分析结果判定读值与ASFV抗原含量成正比。被检样品读值<12,则判定为ASFV抗原阴性；被检样品读值≥16,则判定为ASFV抗原阳性；12<被检样品读值<16,则判定为可疑。可疑样品读值<12,则判定为ASFV抗原阴性；可疑样品读值≥12,则判定为ASFV抗原阳性。9GB/T18648—202011夹心ELISA抗原检测方法11.1.2酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的P30蛋白单抗(针对P30蛋白的不同表位)。11.2.2恒温孵育箱。11.2.5“U”型96孔稀释板。P30蛋白单克隆抗体用包被缓冲液1:200倍稀释后，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃饱涤缓冲液洗板4次后拍干。11.3.2夹心ELISA抗原11.3.2.5弃去反应孔中的液体，每孔用洗涤缓冲液清洗4次，洗涤缓冲液300μL/孔。11.3.2.8用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值。GB/T18648—2020123456789APBPCNDNEFGHP-——阳性对照孔；N——阴性对照孔；11.5夹心ELISA抗原检测结果判定在试验成立的前提下，待检样品OD₄5o>0.12,则判定该待检样品为ASFV抗原阳性；OD₄5则判定该待检样品为ASFV抗原阴性。12间接ELISA抗体检测方法见11.2。GB/T18648—2020数条作为检测孔，使用抗原稀释液包被96孔酶标板偶数条作为对照孔，37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干，300pL/孔加入封闭缓冲液，37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板412.3.2间接ELISA抗体检测操作步骤12.3.2.1待检血清与阴性、阳性对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。的待检血清，37℃孵育60min。12.3.2.8用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值，按式(1)计算OD₄50差值。OD450-c=OD₄50-J一OD₄50-0……(1)OD₄50-o—--OD₄5偶数孔值。123456789APPBPPCNNDNNEFGHP---—阳性血清对照孔；图2样品加样记录表(推荐模式)12.5间接ELISA抗体检测结果判定在试验成立的前提下，待检样品OD₄50差>0.2,则判定该待检样品为ASFV抗体阳性；待检样品GB/T18648—202013阻断ELISA抗体检测方法13.1.1包被抗原：杆状病毒表达的ASFVP30重组蛋白。13.1.2酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的抗ASFVP30蛋白单抗。见11.2。用包被缓冲液将ASFVP30重组蛋白稀释成终浓度为0.3μg/mL,每孔100μL包被96孔酶标板，2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。13.3.2阻断ELISA抗体检测操作步骤13.3.2.2弃去反应孔中的液体，每孔用洗涤缓冲液清洗5次，洗涤缓冲液300μL/孔。13.3.2.4弃去反应孔中的液体，每孔用洗涤缓冲液清洗5次，洗涤缓冲液300μL/孔。GB/T18648—2020123456789APBPCNDNEFGHP——阳性血清对照孔；N———阴性血清对照孔；Cm—-—酶标单抗对照孔；图3样品加样记录表(推荐模式)13.4阻断率计算方法阻断率按式(2)～式(4)计算：BRs=100—(OD₄50-s×100)÷OD₄50-Cm (2)BRNc=100—(OD₄50-Nc×100)÷OD₄50-Cm (3)BRpc=100—(OD₄50-pc×100)÷OD₄50-Cm (4)式中：BRs——待检血清样品阻断率；BRNc——阴性对照血清阻断率；BRpc——阳性对照血清阻断率；OD₄50-s——待检血清样品OD₄50值；OD₄50-pc——阳性对照血清OD₁50值；OD₄50-Cm——酶标单抗对照OD₄50值。13.5试验成立条件阳性对照阻断率>70,且阴性对照阻断率<30,试验结果有效；否则，应重新进行试验。13.6阻断ELISA抗体检测结果判定在试验成立的前提下，待检样品阻断率>50,则判定为ASFV抗体阳性；待检样品阻断率≤50,则判定为ASFV抗体阴性。14夹心ELISA抗体检测方法14.1试剂GB/T18648—2020见11.2。ASFV重组P54蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL,按每孔100μL的量包被96孔酶湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。14.3.2ELISA操作步骤14.3.2.1酶标板上对照和样品的分布图，见图4。在A1和B1孔加入ASFV阳性对照血清各50μL,在Cl和D1孔加入ASFV阴性对照血清各50μL;剩余孔中加入待检样品血清50μL。14.3.2.2轻轻振匀孔中样品(勿溢出),37℃孵育20min。14.3.2.4每孔加入50μL的酶标抗原(1×);37℃孵育20min。14.3.2.5甩干ASFV抗原包被板孔中的液体，每孔加入300μL洗涤缓冲液，洗涤5次，在洗涤和加入14.3.2.6每孔加入50μL底物溶液A和50μL底物溶液B;37℃避光孵育10min。14.3.2.7每孔加入50μL终止液终止显色反应；使用酶标仪测定450nm波长处的OD值。123456789APBPCNDNEFGH图4样品加样记录表(推荐模式)14.4试验成立条件OD₄50-Nc值≤0.15且OD₄50-pc值≥0.6,试验结果有效；否则重新进行试验。14.5夹心ELISA抗体检测结果判定CutOff值按式(5)计算：CutOff=OD₄50-sOC₄50-Nc……(5)式中：OD₄50-s———待检血清样品OD₄50值；OD₄50-NC——阴性对照血清OD₄50值。在试验成立的前提下，CutOff值≤0.15,则判为ASFV抗体阴性；CutOff值>0.15,则判为ASFV抗体阳性。15间接免疫荧光方法15.1.1制备抗原板：感染ASFV的细胞或者感染重组病毒(表达ASFV蛋白)的细胞固定于固相载体。15.1.2对照血清：ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清。15.1.3荧光二抗：羊抗猪IgGH&.L(FITC)。15.1.4细胞固定液：丙酮、甲醇按1:1比例配置。15.1.5封闭缓冲液，配制方法见C.2。15.1.6稀释缓冲液，配制方法见C.3。15.1.7洗涤缓冲液，配制方法见C.4。GB/T18648—202015.2.224孔细胞培养板。15.2.3旋转振荡器。15.2.4恒温培养箱。15.2.6与移液器匹配的吸头。15.2.7吸水纸巾。选择合适细胞铺制24孔细胞培养板，待细胞生长至80%时，进行细胞计数。按合适的病毒量接种ASFV种毒或表达ASFV蛋白的重组病毒，37℃维持培养约48h。每孔加入200pL预冷细胞固定液将细胞固定10min,弃去固定液，将细胞培养板晾干。晾干后储存于-20℃冰箱备用。15.3.2间接免疫荧光检测操作步骤15.3.2.1将固定的抗原板从-20℃冰箱中取出，每孔用洗涤缓冲液清洗3次，洗涤缓冲液1000μL/孔。15.3.2.2抗原板上对照和样品的分布图，见图5。弃去反应孔中的液体，在A1孔加入200μL阳性对23456APBNCDP——阳性血清对照孔；N——阴性血清对照孔；图5样品加样记录表(推荐模式)15.3.2.3弃去反应孔中的液体，每孔用洗涤缓冲液清洗3次，洗涤缓冲液1000μL/孔。15.3.2.4用稀释缓冲液将荧光二抗稀释至工作浓度，200μL/孔，37℃孵育50min。15.3.2.5弃去反应孔中的液体，每孔用洗涤缓冲液清洗3次，洗涤缓冲液1000μL/孔。15.3.2.6荧光显微镜观察结果。阳性对照出现特异性绿色荧光，且阴性对照无特异性绿色荧光，试验结果有效；否则，应重新进行试验。GB/T18648—202015.5间接免疫荧光结果判定在试验成立的前提下，待检样品出现特异性绿色荧光，则判定待检样品为ASFV抗体阳性。待检样品无特异性绿色荧光，则判定待检样品为ASFV抗体阴性。待检样品出现非特异性绿色荧光或荧光信号较弱，则判定待检样品为ASFV抗体可疑，建议重新检测血清样品或用不同的方法重新检测。16综合判定16.1经5.4判定为疑似ASF病例，经普通PCR方法(见第7章)、荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方法(见第9章)任一项检测出ASFV核酸阳性的，或经高敏荧光免疫分析法(见第10章)、夹心ELISA抗原检测方法(见第11章)任一项检测出ASFV抗原阳性的，可诊断为ASF病例。如经普通PCR方法(见第7章)检测出ASFV核酸阴性的，或经高敏荧光免疫分析法(见第10章)、夹心ELISA抗原检测方法(见第11章)检测出ASFV抗原阴性的，仍需经荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方法(见第9章)进行再检，任一项检出ASFV核酸阳性的，可诊断为ASF病例。16.2无明显临床症状的易感动物，经普通PCR方法(见第7章)、荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方法(见第9章)任一项检测出ASFV核酸阳性的，或经高敏荧光免疫分析法(见第10章)、夹心ELISA抗原检测方法(见第11章)任一项检测出ASFV抗原阳性的，可诊断为ASFV感染；如经普通PCR方法(见第7章)检测出ASFV核酸阴性的，或经高敏荧光免疫分析法(见第10章)、夹心ELISA抗原检测方法(见第11章)检测出ASFV抗原阴性的，仍需经荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方法(见第9章)进行再检，任一项检出ASFV核酸阳性的，可诊断为ASF感染。16.3经间接ELISA抗体检测方法(见第12章)、阻断ELISA抗体检测方法(见第13章)、夹心ELISA抗体检测方法(见第14章)、间接免疫荧光方法(见第15章)任一项检测出ASFV抗体阳性的，可诊断为ASFV抗体阳性；如经间接ELISA抗体检测方法(见第12章)、阻断ELISA抗体检测方法(见第13章)、夹心ELISA抗体检测方法(见第14章)检测结果不一致的，需经间接免疫荧光方法(见第15章)进GB/T18648—2020(规范性附录)样品保存液的配制方法A.10.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)氯化钠(NaCl)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)加去离子水至氯化钠(NaCl)氯化钾(KCl)磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)磷酸二氢钾(KH₂PO₄)加去离子水至A.20.04mol/LPBS(pH7.4)0.1mol/LPBS400mL