核细胞基因组DNA的分离提取、RE酶切及电泳

真核细胞基因组DNA的分离提取、RE酶切及电泳

实验仪器的使用及注意事项

一、加样器的使用方法：

1、加样器介绍

(1)选择适当量程的加样器规格:1000

l；

200

l;20

l规格(2)如何读数:

1.观察加样器最大量程;2.根据最大量程读数。

例如：加样器读数为0451000

l:450

l200

l:45

l20

l：4.5

l

((3)如何调节:

顺时针调节---读数变小逆时针调节---读数变大易发生于：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程。注意：超过最大量程及最小量程的调节，将会损害加样器的精度。2、加样器使用步骤：（1）吸头的安装要紧密。（2）吸取液体前，先打到第一挡。（3）将吸头插入液面下适当深度，不宜过深或过浅。（4）缓慢松开拇指，吸取液体。（5）完全放开拇指后，吸头在液面下停留一下(约半秒钟)。（6）抬起加样器，将外壁液体用容器口引流回容器。观察吸头

内的液面，大致估计吸取的体积是否正确。（7）贴目的容器内壁，将液体匀速打到目的容器内，加样器推

到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出。（8）取下加样器头，放到废物盒内（有时候根据实验需要也可不换枪头）。加样器使用注意事项

吸头内有液体时，不能将加样器倒置，以防液体倒流损坏加样器！防止有机溶剂（ORGANICREAGENT）腐蚀仪器不要超过最大量程

TIP头的使用：防止污染试剂瓶中的试剂USEOFAUTOMATICPIPPETTE二、离心机的使用注意事项：

1.

①样品平衡;②

设定离心时间;③逐渐升到要求转速。转轴两侧对称放置等量液体的离心管

2.

离心管的盖子要盖严，以防液体漏到离心机内。

3.单只离心管离心微量液体时

对侧放置装有等量体积dddH2O的空离心管；

体积极微（几µl——十几µl）时，对侧放置空离心管。注意:离心时离心机内样品要平衡实验中注意事项：

1、统一离心，实验统一步调；

2、看好试验台上都有哪些器材、试剂等，是否齐备；

3、实验结束后主动整理实验台;

白细胞分离

1.领取一支装有0.3ml抗凝血的1.5ml微量离心管。2.加入1mlSTMT溶液，（破坏细胞膜），充分混匀，使其溶血。3.

10,000rpm,离心2min(4个小组统一离心)。弃上清。

注意:离心时离心机内样品要平衡实验步骤

蛋白酶K消化４、用1.0ml生理盐水洗沉淀，10000rpm/min离心2min，弃上清。５、加450μlNE溶液将沉淀重新悬浮。６、加50μl10%SDS，迅速混匀，再加50μl蛋白酶K，轻轻摇匀后置50℃水浴1h。实验目的掌握人外周血基因组DNA的提取技术2.学习酶切原理与技术.3.学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。

真核细胞与原核细胞基因组的区别制备DNA的原则

既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，

又要保持DNA分子的完整性

Conciseprocess：(酚抽提法)破裂细胞,消化蛋白质→有机抽提除去蛋白质→沉淀水相中的DNA。

真核细胞基因组DNA的制备酚抽提法提取基因组DNA的原理1、裂解细胞用SDS溶解细胞膜、核膜上脂质成分；蛋白酶K消化细胞上包括组蛋白在内的蛋白成分。达到裂解细胞、分离DNA和组蛋白的目的。2.去除蛋白等杂质成分酚和氯仿可使抽提样品中的蛋白质变性沉淀，通过离心去除。酚对蛋白有强烈的变性作用，为防止其对后续实验的影响，再用氯仿抽提去除残留的酚。3.沉淀DNA

在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA链之间发生聚集沉淀，通过-20℃冻存后，离心获得DNA。

讲解原理，流程图1。5HOUR

[Procedure](1)

bloodgenomicDNApurification3。5hr破碎细胞阶段

0．3mlblood(in1.5mlEppendorftube)

↓add1mlSTMT,mix

↓Centrifuge10000×g,2min

１、取0.3ml抗凝全血，加入1.5mlEppendorf离心管中。２、加入1mlSTMT（破坏细胞膜），充分混匀使其溶血。３、10000rpm/min离心2min，弃上清。

TritonX-100

非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及细胞核。MgCl2：

提供Mg2+稳定DNA.破裂细胞:获得白细胞核（与核外杂质分离）消化蛋白阶段SupernatantPrecipitate

Washwith1ml0.9%NaCl

Centrifuge10000×g,2min

SupernatantPrecipitateSuspendwithNE450μl

Add10%SDS50μl,mix

AddproteinaseK50μl,mix

Incubateat500C,1-2hr.４、用0.4ml生理盐水洗沉淀，10000rpm/min离心2min，弃上清。６、加50μl10%SDS，迅速混匀，再加50μl蛋白酶K，轻轻摇匀后置50℃水浴1h。５、加450μlNE溶液将沉淀重新悬浮。消化蛋白质:组蛋白与DNA分离，并溶解入水相中有机抽提阶段

第一次Addphenol500μl,mix

Centrifuge10000×g,2minOrganicphaseAqueousphase(upper)→removetoanothertube第二次Addphenol/chloroform/isopentanol(25:24:1),mix

Centrifuge10000×rpm,1min

７、加入TE饱合酚500μl，轻摇2min，10000rpm离心1min，将上层水相移至另一Eppendorf管内。８、加入酚－氯仿－异戊醇混合液500μl，轻摇1min，10000rpm离心1min，将上层水相移至另一Eppendorf管内。有机抽提：除去蛋白质等杂质操作注意:莫将有机相带入水相注意事项1、TE饱和酚:下层酚相,上层为水相，注意不要抽取。2、抽取酚的加样器头用过即弃掉。

3、转移水相时，要尽量抽尽，又不可吸起酚相。

4、为避免DNA链由于物理因素断裂，轻柔操作。

0.1%8-羟基喹啉（黄色）：显示酚氧化状态的指示剂。酚和氯仿是两种蛋白变性剂，但性质不全相同。酚不能抑制RNAase的活性，而且尚能溶解入10％一l5％的水分,能损失DNA和溶解掉一部分ploy(A)RNA。氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖等作用。但氯仿的变性作用不如酚好，故一般应用酚和氯仿两者交替反复抽提，可克服酚的缺点，能达到去除与核酸相隔的蛋白质的目的。抽提末了，再用氯仿处理，可除去痕量的酚。第三次抽提OrganicphaseAqueousphase(upper)→removetoanothertube

(lowerphase)Addchloroform/isopentanol(24:1),mix

Centrifuge10000×rpm,1min９、加入氯仿－异戊醇(24:1)500μl，轻摇1min，10000rpm离心1min，将上层水相移至另一Eppendorf管内。注意:一定要记录水相体积提示:水相体积是多少操作注意:千万莫将有机相带入水相CarefulremovaloftheaqueousphaseiscriticalforthequalityoftheisolatedDNA

从水相中沉淀DNAOrganicphaseAqueousphase(upper)→removetoanothertube

Add1/10volume3mol/LNaAc,mix

Add2×volumealcohol(freeofwater)

问题：为什么加NaAc核酸与阳离子核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁很多1价、2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠、氯化锂、氯化钾、氯化镁等，但以2价离子镁的沉淀效率最高。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等。10、加入1/10体积（约50ul）醋酸钠于上清中。11、加入2-2.5倍体积（约1ml）无水乙醇，混匀,置-20°C1小时或-70°C15min。无水乙醇：处于高盐状态DNA，在乙醇溶液中的溶解度降低，可利用此特性沉淀DNA。醋酸钠(3mol/LpH:5.2)：提供高盐环境。

沉淀的干燥和溶解SupernatantPrecipitate(DNApellet)

(discard)dryinairorat370C

RedissolvingpelletwithdddH2O8.0μl

(genomic)DNASolution8.0μl12、12,000rpm,3min,弃上清。13、室温干燥10min或370C下5min

14、用滤纸条吸干小管内壁液体，室温干燥10min，观察DNA淡黄色沉淀。15、加入8

l双蒸水,溶解沉淀.操作注意事项：

1、注意滤纸条不要接触沉淀。

2、双蒸水溶解沉淀要充分，但不要倒置离心管.实验第二部分：限制性核酸内切酶酶切基因组DNA

向DNA溶液加入8

l双蒸水,溶解沉淀.加1

l10×Buffer、1

l内切酶，置37℃,45min-1.5hour。

注意

1．酶切时注意微量加样的准确。事项

2．内切酶最后加入。

Procedure(2)

DNAdigestedwithrestrictionendonuclease（RE）

Procedure(3)electrophoresis;

实验第三部分：琼脂糖凝胶电泳示教：1%琼脂糖凝胶制备下午上课时间：1:00溴乙锭（染色剂):EB一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA的碱基之间，在紫外光激发下能发出红色的荧光。是一种强致癌剂.

操作时要带手套.琼脂糖凝胶电泳操作

1%琼脂糖凝胶电泳于DNA酶切样品中加1-2ul上样缓冲液(10×LoadingBuffer含指示染料，蔗糖等)，混合后加入上样孔内．电泳条件:恒定电压80V-１００伏

电泳时间４０－６０分钟．电泳后，紫外透射仪观察DNA酶切结果,或照相分析.预期实验结果DNAMarker(Ladders)用于比较样品中不同大小DNA片段的泳动距离.

限制性核酸内切酶是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的脱氧核糖核酸水解酶。例如,HindIII的酶切位点是

A/AGCTT。

用限制性核酸内切酶对基因组DNA进行消化,可以产生一系列长度不一的

DNA片段。

限制性内切酶分三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。

Ⅰ和Ⅲ型同时具有限制和修饰两种功能，而且Ⅰ

型没有固定的切割位点，随机切割DNA而产生非专一性切口，所以在分子克隆中用处不大。Ⅱ型酶对DNA切割有很强的特异性，因此成为分子生物学的工具酶。Ⅱ型酶识别4-6个碱基的回文顺序，在特定位点切割双链DNA，通常产生三种不同的切口，5’端突出的粘性末端、3’端突出的粘末端和平齐末端。

酶活性单位（U）：是指在1小时内，适当温度下，在50ul反应体系中，将1ug底物DNA完全消化所需的酶量。酶切体系：10×反应缓冲液：提供内切酶反应最适pH值及所需离子。内切酶：含50%甘油，－20℃保存。反应体积：一般根据底物DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度应<10%。双蒸水：无细菌和其他酶类污染。琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子在pH8.0环境下带负电荷，在一定强度电场力的作用下，DNA分子从负极向正极泳动。琼脂糖是一种线性多糖聚合物，煮沸冷却后形成胶状网格样结构，在电泳过程中起分子筛作用。通常情况下，分子量大的DNA电泳过程中由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分子量较小的DNA片段跑在前面。用限制性核酸内切酶对基因组DNA进行消化,可以产生一系列长度不一的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳常用试剂上样液成份：(10×LoadingBuffer)1）0.25%溴酚蓝或/和0.25%二甲苯酚---样品指示剂。

2）40%蔗糖或30%甘油

---增加样品比重，利于加样。电泳缓冲液：TAE为例:T:Tris碱A:冰乙酸E:EDTApH值(8.0)具有缓冲能力,EDTA可抑制DNA酶活性。溴乙锭（染色剂):EB一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到DNA或RNA的碱基之间，在紫外光激发下能发出红色的荧光。琼脂糖凝胶浓度

琼脂糖浓度（%）线性DNA片断大小（kb)）

0.45–600.70.8–101.00.4–61.50.2–41.750.2–32.00.1–3根据DNA片断的不同长度应采用不同浓度的琼脂糖才能达到较好的分离效果：根据需要的凝胶浓度称取一定量琼脂糖粉将琼脂糖粉放入容器中加入电极缓冲液用微波炉加热化胶，直到琼脂糖粉完全溶解在缓冲液中,凝胶溶液呈清澈透明状脂糖凝胶.

插上梳子

凝胶冷却凝固.

电极缓冲液加到电泳槽中,拔出梳子形成加样孔.DNA样品和

loadingbuffer混合,将DNA样品加入加样孔中,加DNAMarker又称Ladder.通过观察loadingbuffer中指示剂的迁移距离可推断样品在凝胶中的电泳情况.由于凝胶中加入了EB，它是一种核酸染料可以和DNA结合在紫外灯下可观察到不同DNA片段的迁移距离.未经酶切的DNA样品由于片段大，在加样孔附近可看到一条很亮的DNA带。

DNA样品用HindIII酶切后，形成弥散带.DNAMarker(Ladders)用于比较样品中不同大小DNA片段的泳动距离.所用试剂作用1、

STMT溶液

S:Sugar8%T:TritonX-1001%M:MgCl20.5mMT:Tris-HCL10mM(PH:8.0)作用：提供低渗环境，同时TritonX-100可在细胞膜上打孔，有助于红细胞裂解去除Hb。2、NE溶液

N:NaCl50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：螯合Ca2+Mg2+离子，抑制DNA酶活性。3、TE饱和重蒸苯酚重蒸酚：去除了苯酚中杂质；使蛋白质变性。TE溶液:Tris-Hcl10mM(pH:8.0)