第24章 疱疹病毒案例课件

疱疹病毒

herpesviruses,HV

第24章第24章疱疹病毒案例掌握疱疹病毒的致病性熟悉疱疹病毒的生物学性状了解疱疹病毒的检查方法和防治原则教学目的第24章疱疹病毒案例疱疹病毒(Herpesvirus)是一类中等大小、结构相似、有包膜的DNA病毒。现已发现114种，分3个亚科已知的人类疱疹病毒有：单纯疱疹病毒1型和2型 （HSV1&2）水痘—带状疱疹病毒 （VZV）巨细胞病毒 （CMV）EB病毒 （EBV）人类疱疹病毒6型、7型、8型（HHV6,7,8）第24章疱疹病毒案例正式命名常用名病毒亚科重要生物学性状所致疾病人类疱疹病毒1型（HHV-1）单纯疱疹病毒1型（HSV-1）

繁殖快、杀细胞性感染感觉神经节中潜伏唇疱疹、龈口炎、角膜结膜炎、脑炎等人类疱疹病毒2型（HHV-2）单纯疱疹病毒2型（HSV-2）

同上生殖器疱疹、新生儿疱疹人类疱疹病毒3型（HHV-3）水痘-带状疱疹病毒（VZV）

同上水痘、带状疱疹、脑炎人类疱疹病毒4型（HHV-4）Epstein-Barr病毒（EBV）

淋巴细胞中繁殖与潜伏传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（?）等人类疱疹病毒5型（HHV-5）人类巨细胞病毒

常在淋巴细胞、肾脏及分泌腺体中潜伏先天性巨细胞包涵体病、单核细胞增多症、间质性肺炎、先天性畸形、肝炎人类疱疹病毒6型（HHV-6）人类疱疹病毒6型

同人巨细胞病毒婴儿急疹、间质性肺炎、骨髓抑制人类疱疹病毒7型（HHV-7）人类疱疹病毒7型

同人巨细胞病毒未明确人类疱疹病毒8型（HHV-8）人类疱疹病毒8型

同EB病毒Kaposi肉瘤弥猴疱疹病毒1猿猴B病毒

同HSV脊髓炎、出血性脑炎第24章疱疹病毒案例疱疹病毒的共同特征病毒颗粒呈球形，120～300nm。核衣壳约100nm。20面体立体对称，有包膜双链线形DNA第24章疱疹病毒案例除EB病毒及HHV-6、HHV-7和HHV8外，均能在人二倍体细胞内复制，产生明显CPE，并有核内嗜酸性包涵体，形成多核巨细胞多种感染类型:显性感染潜伏感染整合感染先天性感染第24章疱疹病毒案例Herpessimplexvirus,HSV第一节单纯疱疹病毒第24章疱疹病毒案例单纯疱疹病毒案例

患者，女，20岁。因经常出现口唇黏膜处水疱而就诊，患者发热时口唇周围常起针头大小的小疱，常为一群，也有两三群，自觉有轻度烧灼感，历时1周左右可自愈，反复发作多次，并伴有口腔溃疡、咽炎、舌炎等现象。第24章疱疹病毒案例思考题：1该患为何种病原体感染？病原体存在于何处？2潜伏感染的定义是什么？第24章疱疹病毒案例单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒，由于在感染急性期发生水疱性皮疹即所谓单纯疱疹而得名包括两个血清型HSV-1HSV-2第24章疱疹病毒案例一、生物学性状第24章疱疹病毒案例生物学性状典型的疱疹病毒科病毒特征HSV有两个血清型，即HSV-1和HSV-2。两者DNA的同源性约为50%病毒体有六个包膜相关糖蛋白：gpB、gpC、gpD、gpE、gpG和gpH。gpC是型特异抗原，只有HSV-1有。gpD是病毒中和抗原，是亚单位疫苗的备选蛋白第24章疱疹病毒案例在多种细胞增殖，病毒复制快（48h），出现细胞肿胀变圆和核内嗜酸性包涵体CPE第24章疱疹病毒案例二、致病性与免疫性第24章疱疹病毒案例性接触垂直传播传播途径密切接触传播：唾液、阴道分泌物、疱疹液，接吻，共用杯子，牙刷等。第24章疱疹病毒案例HSV感染较普遍

密切接触和性接触

经粘膜和破损皮肤上皮细胞内复制，水疱浆液充满病毒颗粒，细胞碎片，基底部多核巨细胞；神经细胞则为潜伏感染。皮肤损伤性水疱第24章疱疹病毒案例

原发感染

表现：粘膜与皮肤的局部疱疹HSV-1：腰以上感染为主唇疱疹龈口炎角膜结膜炎等

第24章疱疹病毒案例HSV-2：腰以下及生殖器感染为主

生殖系统疱疹、新生儿疱疹等第24章疱疹病毒案例

潜伏感染

原发感染后,HSV由感觉神经

感觉神经节

HSV-1:三叉神经节和颈上神经节

HSV-2:骶神经节

潜伏的HSV不复制，对抗病毒药物不敏感第24章疱疹病毒案例复发性感染

非特异性刺激：发热、月经、感染等激活潜伏病毒沿感觉神经纤维下行到末梢感染粘膜或皮肤上皮细胞免疫记忆反应病程短,组织损伤轻,感染更局限

第24章疱疹病毒案例先天性感染及新生儿感染：妊娠期妇女（HSV-1）

影响胚胎细胞的有丝分裂胎儿畸形、智力低下、流产。分娩--------新生儿疱疹第24章疱疹病毒案例HSV-2可能引起宫颈癌患过生殖器疱疹的妇女，宫颈癌发病率高用免疫荧光检查癌组织HSV-2抗原患者HSV-2抗体效价高宫颈疱疹与宫颈癌好发部位相似分子杂交试验发现HSV-2基因片段尚不能作出结论。HSV-2可能是一种辅助致癌因子，或是一种与之无关的“过客”病毒第24章疱疹病毒案例

免疫IFN和NK细胞：限制原发感染发展中和抗体：阻断病毒扩散及潜伏感染细胞免疫：控制和消除HSV感染第24章疱疹病毒案例三、微生物学检查法第24章疱疹病毒案例检测核酸

PCR或原位杂交检测抗原

荧光素或酶标记抗体染色分离病毒

标本：水疱液、唾液细胞：BHK-21，Vero

CPE：细胞肿胀；融合细胞；包涵体第24章疱疹病毒案例防治原则预防避免同患者接触防止医院内感染剖腹产预防新生儿感染

HSV有致癌可能性，减毒活疫苗和死疫苗不宜用于人体包膜蛋白（提纯的gG、gD）亚单位疫苗基因重组疫苗、多肽疫苗治疗正研制国内用HSVgCgD单克隆抗体制成滴眼液，用于治疗疱疹性角膜炎，取得显著疗效无环鸟苷（ACV）对疱疹病毒选择性很强的药物第24章疱疹病毒案例单纯疱疹病毒案例

患者，女，20岁。因经常出现口唇黏膜处水疱而就诊，患者发热时口唇周围常起针头大小的小疱，常为一群，也有两三群，自觉有轻度烧灼感，历时1周左右可自愈，反复发作多次，并伴有口腔溃疡、咽炎、舌炎等现象。第24章疱疹病毒案例思考题：1该患为何种病原体感染？病原体存在于何处？2潜伏感染的定义是什么？第24章疱疹病毒案例案例提示

根据临床表现为单纯疱疹病毒——1型感染。不同的疱疹病毒其体内潜伏部位不同，ＨＳＶ——1主要潜伏于三叉神经节或颈上神经节，ＨＳＶ——2潜伏于骶神经节，ＥＢＶ主要潜伏于Ｂ淋巴细胞内。第24章疱疹病毒案例

原发感染后少数病毒不被清除，以非活化状态存留于机体内。病毒不增殖，也不破坏细胞，与宿主细胞处于暂时平衡状态。一旦病毒被再激活，可转为显性感染，疾病复发。第24章疱疹病毒案例Varicellazostervirus（VZV）第二节水痘-带状疱疹病毒第24章疱疹病毒案例水痘带状疱疹病毒案例患者，男，58岁。因感冒发热2天后胸部皮肤产生水疱疹，水疱逐渐增多并显著疼痛就诊。查体见患者胸部皮肤有片状水疱，沿肋缘分布形成带状。第24章疱疹病毒案例思考题：1该患为何种病原体感染？2该病怎样进行预防和治疗？第24章疱疹病毒案例水痘－带状疱疹病毒（VZV）在儿童初次感染时引起水痘（Varicella），恢复后病毒潜伏在体内，青春期或成年以后少数人复发可引起带状疱疹（Zoster），故称为水痘－带状疱疹病毒（Varicella-ZosterVirus）第24章疱疹病毒案例与HSV相似：

①潜伏神经细胞，引起复发感染②细胞免疫限制和防止重症水痘③皮肤损伤以水疱为特征与HSV不同：

①呼吸道感染

②通过病毒血症播散至皮肤一、生物学性状第24章疱疹病毒案例水痘和带状疱疹二、致病性与免疫性第24章疱疹病毒案例致病性传染源主要是患者，水痘患者急性期水疱内容物及上呼吸道分泌物、或带状疱疹患者水疱内容物都含有病毒病毒借飞沫经呼吸道或接触传播好发年龄为3～9岁，多在冬季春季流行第24章疱疹病毒案例原发感染：水痘，一般病情较轻潜伏感染：原发感染后，病毒潜伏于脊髓后根神经节或颅神经的感觉神经节。以后如机体免疫力下降，病毒被激活，病毒沿神经轴突下行到所支配的皮肤细胞内增殖，发生疱疹，排列呈带状，称带状疱疹发生于身体的一侧，以躯干中线为界，好发部位为胸、腹和面部多见于成年人，特别是40岁以上成年人第24章疱疹病毒案例水痘(ChickenPox)病毒经呼吸道、结膜、皮肤等处侵入人体先在局部淋巴结增殖进入血液散布到各个内脏继续大量增殖2～3周潜伏期皮肤广泛发生丘疹，水疱疹和脓疱疹第24章疱疹病毒案例带状疱疹（Shingles）儿童时期患过水痘愈合病毒潜伏在脊髓后根神经节或脑感染神经节中机体免疫力下降等条件刺激病毒沿感觉神经轴索下行该神经所支配的皮肤细胞内增殖在皮肤上沿着感觉神经的通路发生串联的水疱疹，形似带状第24章疱疹病毒案例免疫性儿童患水痘后，机体产生持久的特异性细胞免疫和体液免疫，极少再患水痘病毒中和抗体和细胞免疫不能有效地清除潜伏于神经节中的病毒，故不能阻止病毒被激活而发生带状疱疹第24章疱疹病毒案例诊断：似HSV治疗：①无环鸟苷②IFN：限制疾病预防：减毒活疫苗三、微生物学检查法与防治第24章疱疹病毒案例防治原则VZV减毒活疫苗预防水痘感染和传播有良好效果治疗可用无环鸟苷、阿糖腺苷和高剂量干扰素第24章疱疹病毒案例水痘带状疱疹病毒案例患者，男，58岁。因感冒发热2天后胸部皮肤产生水疱疹，水疱逐渐增多并显著疼痛就诊。查体见患者胸部皮肤有片状水疱，沿肋缘分布形成带状。第24章疱疹病毒案例思考题：1该患为何种病原体感染？2该病怎样进行预防和治疗？第24章疱疹病毒案例提示根据临床表现为单纯疱疹病毒——2型感染。第24章疱疹病毒案例提示VZV减毒活疫苗预防水痘感染和传播有良好效果，接种对象为1岁以上末患过水痘的儿童和成人。对免疫功能低下者可用高效价人免疫球蛋白进行紧急预防。治疗可用无环鸟苷、阿糖腺苷和高剂量干扰素第24章疱疹病毒案例Humancytomegalovirus（HCMV）第三节人巨细胞病毒第24章疱疹病毒案例人类巨细胞病毒（HCMV）1956年Smith等首先用组织培养方法从患者腺体组织培养中分离出病毒。由于感染的细胞肿大并具有巨大的核内包涵体故得名是巨细胞包涵体病的病原体CMV多为潜伏感染，常可由怀孕、器官移植、免疫抑制、艾滋病等因素被激活第24章疱疹病毒案例形态结构：与HSV极相似宿主范围：

较窄，不感染其它动物；仅成纤维细胞中增殖。一、生物学性状第24章疱疹病毒案例生物学性状典型疱疹病毒结构对宿主或培养的组织细胞感染有高度的种属特异性：即HCMV只能感染人。只能在人成纤维细胞增殖复制周期为36～48h（增殖缓慢），其特点是细胞变圆、膨胀、核变大、形成巨大细胞，核内出现周围绕有一轮鹰眼状大型嗜酸性包涵体（Owl’seyeinclusionbody）第24章疱疹病毒案例致病性潜伏部位唾液腺、乳腺、肾脏、白细胞及其他腺体长期或间歇地从尿液、唾液、泪液、乳汁、精液、宫颈及阴道分泌物排出病毒第24章疱疹病毒案例传播环节传染源患者及无症状隐性感染者传染方式胎盘产道密切接触，通过口口或手口传播输血器官移植第24章疱疹病毒案例先天性感染（宫内感染）通过胎盘感染胎儿。发生率为0.5%~2.5%，CMV是能引起先天性感染的主要病毒之一只有少部分（<10%）感染者表现症状，主要临床表现是巨细胞包涵体病（黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血、紫癜等），极少数患儿表现为先天性畸形（小头智力低下、神经肌肉运动障碍、耳聋、脉络膜视网膜炎等）第24章疱疹病毒案例经产道感染，或出生后数周由母体的病毒（尿或乳汁中的病毒），或护理人员排出的病毒所引起的感染多数无症状或症状轻微，表现为轻声度或明显呼吸障碍、肝功损害通常不表现神经损伤，预后良好围生期感染第24章疱疹病毒案例免疫功能低下的病人感染发生于长期免疫抑制剂治疗、器官移植、AIDS、白血病、淋巴瘤等患者是由于体内原有的潜伏HCMV被激活症状主要是肺炎、视网膜炎、脑炎、脑膜炎等，预后不好第24章疱疹病毒案例输血感染输入大量含有CMV的新鲜血液，可发生输血后的单核细胞增多症和肝炎等HCMV导致的单核细胞增多症检测不到嗜异性抗体和EBV相关抗体，可籍此区别与EBV所致的单核细胞增多症预后良好第24章疱疹病毒案例接触感染唾液、乳汁、尿、精液、宫颈分泌物存在HCMV，通过接吻、性接触、哺乳等方式传染。第24章疱疹病毒案例细胞转化与致癌潜能HCMV基因组的DNA片段，体外可转化地鼠胚和人胚成纤维细胞。接种乳鼠可形成肿瘤。宫颈癌、前列腺癌、结肠癌和Kaposi肉瘤组织检出HCMV的DNA序列。第24章疱疹病毒案例细胞培养：成纤维细胞中增殖，生长慢，CPE需2～6周。ELISA：HCMV-IgM；近期感染；胎儿感染HCMVCPE

包涵体三、微生物学检查法第24章疱疹病毒案例防治原则丙氧鸟苷（ganciclovirDHPG）有防止CMV扩散作用耐丙氧鸟苷的CMV感染可选用磷甲酸钠，但效果比前者差CMV病毒活疫苗致癌潜能的问题有待解决CMV包膜糖蛋白的亚单位疫苗是研究的方向第24章疱疹病毒案例第四节EB病毒Epstein-Barrvirus，EBV第24章疱疹病毒案例EB病毒（Epetein-Barrvirus）Burkkit先生在研究非洲中部的一种发生于儿童的恶性淋巴瘤时曾预测该病是一种病毒感染性疾病。1964年加拿大学者Epstein和Barr从这种恶性淋巴瘤体外培养的淋巴瘤细系中，用电镜观察到一种新的人类疱疹病毒，后被命名为EB病毒第24章疱疹病毒案例形态结构类似HSV一、生物学性状第24章疱疹病毒案例生物学性状典型疱疹病毒，但抗原结构与其他疱疹病毒不同常规方法不能培养。仅能在CD21+的B淋巴细胞中增殖，转化为可长期传代的类淋巴母细胞株。是一种嗜B细胞的疱疹病毒CD21分子是该病毒的受体，故含CD21的粘膜上皮细胞和B淋巴细胞是该病毒的宿主第24章疱疹病毒案例增殖性感染产生的抗原：早期抗原（earlyantigen，EA）：

DNA聚合酶活性,表示EBV增殖

EA抗体：早期抗体,持续几个月，表示近期感染。

第24章疱疹病毒案例衣壳抗原（VCA）：

结构蛋白，存在细胞质和细胞核VCA-IgM出现早，消失快

VCA-IgG出现晚，持续几年EBV膜抗原（MA）：

在细胞表面，属包膜糖蛋白

MA-IgM表示近期感染

MA-IgG可持续存在第24章疱疹病毒案例

潜伏感染

EBV感染B细胞或上皮细胞

潜伏感染细胞含EBV基因组(游离或整合)选择性表达潜伏期抗原，刺激B细胞增生或永生化

第24章疱疹病毒案例

EBV潜伏期抗原核抗原（EBNA）

B细胞核内，为DNA结合蛋白

感染细胞逃避CTL杀伤

与细胞永生化有关

EBNA抗体：感染晚期持续存在潜伏膜蛋白（LMP）

在B细胞表面,致癌蛋白

改变细胞功能,抑制细胞凋亡

阻止潜伏病毒激活功能第24章疱疹病毒案例二、致病性与免疫性EB病毒在人群中广泛感染我国3～5岁儿童感染率达90%以上主要通过唾液传播，也可经输血传染EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞感染B细胞进入血循环可造成全身性感染病毒可长期潜伏第24章疱疹病毒案例传染性单核细胞增多症初次感染大剂量病毒，多见青少年，是一种急性全身淋巴细胞增生性疾病症状为发热、咽炎、颈淋巴腺炎、肝脾肿大、血液中大量异形淋巴细胞持续数月后自愈，预后良好致病性第24章疱疹病毒案例非洲儿童淋巴瘤（即Burkitt淋巴瘤）于中非、新几内亚和美洲温热带地区呈地方性流行多见于5～12岁儿童好发部位为颜面、腭部所有BL病人血清均含EBV抗体，其中80%以上滴度高于正常人在肿瘤组织中发现EBV基因组100%死亡率第24章疱疹病毒案例鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）地区性分部，主要东南亚和华南广东省40岁以上的中老年人从鼻咽癌活检组织中找到EBV鼻咽癌患者血清EBV相关抗原的抗体效价高于正常人NPC患者EBV潜伏感染时间通常很长，在30年左右还不能认为EBV是鼻咽癌唯一致病因素，可能是多种综合因素中的一种第24章疱疹病毒案例免疫性EBV在人群中广泛存在，成人抗体的阳性率达90%以上出现中和抗体，能阻止外源性病毒再感染细胞和体液免疫不能清除体内已经潜伏的EBV第24章疱疹病毒案例异嗜性抗体的检测EBV特异性抗体检测

三、微生物学检查法第24章疱疹病毒案例微生物学检查EBV分离培养困难可用核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物血清学诊断

EBV特异性抗体的检测检测病毒VCA－IgA或EA－IgA抗体，滴度≥1：5～1：10有诊断意义异嗜性抗体凝集试验用于传染性单核白细胞增多症的辅助诊断第24章疱疹病毒案例防治原则我国用基因工程方法构建的同时表达EBVgp320和HBsAg的疫苗，重点使用在鼻咽癌高发区gp320膜蛋白疫苗，正在英国大学生患者中作小规模接种，以期观察该疫苗是否能降低传染性单核细胞增多症的发病率第24章疱疹病毒案例临床病原教研室：孙艳EB病毒感染与多发性硬化症的关系研究第24章疱疹病毒案例

课题来源该课题分别列为黑龙江省教育厅一般科研项目和齐齐哈尔市科技局指令项目，获项目经费1.5万元，学院配备1.5万元。第24章疱疹病毒案例

研究工作概述

该课题于2006年9月启动2008年12月完成全部实验第24章疱疹病毒案例研究工作概述1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相关抗体的检测及EBV核酸的PCR检测2.小鼠MS动物模型制备及EB病毒感染导致的神经系统病理变化的研究第24章疱疹病毒案例研究背景多发性硬化症（MultipleSclerosis，MS）是一种中枢神经系统的脱髓鞘性疾病，病变累及的部位为脑和脊髓。特点为病灶多发，常有缓解和复发，病残性大。表现为多种神经系统的症状和体征。有复发缓解型、继发进展型、原发进展型、复发进展型和良性MS等数种类型，多见于欧洲及北美国家，在西方社会MS是造成青壮年神经性残疾中仅次于外伤的第二大因素。第24章疱疹病毒案例

过去认为此病在我国较罕见，但近年来随着诊断手段和医疗水平的不断提高，陆续有此类病例报道，并且发病率呈上升趋势，尤其是在我国高纬度地区，如黑龙江发病率较高。尽管目前对MS的病因及病理机制尚未完全明了，但认为MS的发病与遗传、病毒、免疫、环境地理等因素有关，是多因素共同作用的结果。第24章疱疹病毒案例关于EB病毒感染与多发性硬化症的关系研究，国外研究只证明，EBV感染与MS发病高度相关，而国内目前尚属空白，至今没有直接的实验证据证明EBV感染可以导致MS二者研究的报道，如果我们能开展此项研究将能填补国内研究领域的空白。第24章疱疹病毒案例

EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)EB病毒是一种嗜淋巴细胞的DNA病毒,主要侵犯B细胞。EB病毒基因组编码6个抗原蛋白,膜壳抗原(VCA)、膜抗原(MA)、早期抗原(EA,可分为弥散成分D和局限成分R)、补体结合抗原(即可溶性抗原S)、EB病毒核抗原(EBNA,分EBNA1和EBNA2)和淋巴细胞检测的膜抗原(LYDMA)。第24章疱疹病毒案例

EBV与人类许多疾病密切相关，如：传染性单核细胞增多症，EBV相关嗜血细胞综合症，鼻咽癌，淋巴瘤等。目前国外研究只证明EBV感染与MS发病高度相关，国内目前尚属空白，至今没有直接的实验证据证明EBV感染可以导致MS的研究。第24章疱疹病毒案例

本课题将从临床抗体检测、病毒核酸检测、MS小鼠神经系统病理变化等方面研究EBV感染与MS发病间的关系，将为探讨MS致病机制和治疗提供理论基础。第24章疱疹病毒案例

ELISA法EBVIgG检测试剂盒（上海生物制品研究所）、多功能酶标仪（奥地利迪肯公司产品）、EBV-DNA-PCR试剂盒(EBV-DNA：269bp,华美生物工程公司)、PCR仪(美国MJ公司产品)、凝胶成像系统、垂直电泳仪豚鼠由哈尔滨兽医研究所提供。

主要试剂和主要仪器第24章疱疹病毒案例1.通过酶免疫法检测对临床MS患者的CSF中EBV特异的IgG水平，对MS患者CSF中EBV核酸的检测。2.构建动物模型，将灭活EBV和EBV提取蛋白接种小鼠足垫，观查神经系统病理变化。实验方法第24章疱疹病毒案例1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相关抗体的检测及EBV核酸的PCR检测1.1研究对象

MS组：选择临床确诊为MS的患者26例，符合Poster等制定的MS诊断标准，男10例，女16例，年龄12~72岁，平均40.1±13.6岁。对照组：4例为紧张性头痛及5例神经衰弱患者，17例为腰麻的痔疮或肛瘘手术患者，男11例，女15例，年龄19~71岁，平均43.2±13.5岁。

MS组与正常对照组两组间患者的年龄、性别间具有均衡性。实验方法第24章疱疹病毒案例1.2实验方法

收集MS组和对照组CSF标本，均在采集30分钟内放入-70℃冰箱中保存备用。1.2.1ELISA法检测脑脊液（CSF）中IgG

严格按照ELISA法EBVIgG检测试剂盒说明书的流程操作，用兔抗人IgG（1mg/ml）包被ELISA板后，加入待测脑脊液（CSF）和HRP标记的羊抗人IgG（1：5000），用DAB显色。用酶标仪于波长490nm测定光吸收值（A490）,IgG浓度与A490值成正比。检测结果采用SSPSforwindows软件包对数据结果进行统计分析，两组间的比较采用t检验，以P＜0.05表示有显著差异。实验方法第24章疱疹病毒案例1.2.2PCR技术检测MS患者脑脊液（CSF）中EBV-DNA

脑脊液（CSF）模板处理方法：取脑脊液（CSF）2ml,用PBS液按等倍稀释为1：4，稀释过程需摇匀，用A法[17]提取模板DNA。取5ul用于常规PCR扩增。PCR扩增参数为：94℃，2min；93℃，30s；55℃,45s;72℃,45s；35个循环后，72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。每批实验均设EBV—DNA阳性质粒对照和无模板的阴性对照。

实验方法第24章疱疹病毒案例

2.小鼠MS动物模型制备及EB病毒感染导致的神经系统病理变化的研究

将灭活的EBV和EBV的提取蛋白分别接种小鼠足垫。病理和免疫组化观察小鼠是否因此导致神经系统发生MS病理变化，从而找到MS患者与EB病毒感染关系的依据。

2.1动物

豚鼠由哈尔滨兽医研究所提供30只，2.5月龄,雌雄各半,体重350g左右。实验方法第24章疱疹病毒案例

2.2EBV的制备

EBV的制备及灭活将B95－8细胞株用RPMI1640(含10%胎牛血清和2mmol/L谷氨酰胺)调整细胞密度至1×109个细胞/L,接种于培养瓶中，隔日半量换液,并适时进行传代培养。将培养的细胞饥饿14天后,收集培养上清500ml,于4℃以

22000r/min离心1小时。弃上清,用10mlIMDM培养基重悬沉淀,并浓集50倍,0.45μm滤膜过滤。

实验方法第24章疱疹病毒案例

2.3MS动物模型的制备

实验分两组:(1)实验组,21只，取EBV悬液,加福(氏)完全佐剂(CFA),乳化后按体重注入豚鼠后足掌,抗原量约为按体重0.66μg/g。免疫后约8～9天发病,发病动物出现不同程度肢体无力,体重减轻,继之瘫痪,伴有尿便障碍,有的抽搐死亡。

(2)对照组，9只，取EBV悬液5ml56℃加热灭活60分钟，加CFA注入,此组动物不发病。实验方法第24章疱疹病毒案例

2.4取材

动物处死后立即将脑和脊髓取出,除留少量组织置于3%(体积分数)戊二醛中,其余均置于40g/L的多聚甲醛中固定,固定后2周取材,取脑室周围的脑实质,脊髓分颈、胸、腰3段。

2.5组织病理

HE染色及Weil铁矾苏木素染色。

2.6半薄切片及超薄切片

哈尔滨医科大学电镜室制备。

实验方法第24章疱疹病毒案例

1.脑脊液（CSF）中IgG的检测

ELISA法检测MS组和正常对照组脑脊液（CSF）中IgG含量，MS组脑脊液（CSF）中IgG含量平均为（x±s）：0.026±0.002，（26例临床确诊为MS患者CSF中IgG含量在0.016~0.047ng/ml之间）；正常对照组脑脊液（CSF）中IgG含量平均为（x±s）：0.005±0.002（26例正常对照组CSF中IgG含量在0.002~0.008ng/ml之间）。以EBVIgG4倍升高作为诊断依据。

结果：MS组CSF中IgG含量异常的百分率为76.93%（20/26）；对照组CSF中IgG含量异常的百分率为0。

实验结果第24章疱疹病毒案例

2.PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，并以PCRMarker(x174)为分子标准参照物，以PCR扩增产物在269bp处有扩增条带者为EBV-DNA阳性，反之为阴性，电泳结果见图1-4。MS组EBV-DNA阳性率为94.6%（24/26），正常对照组EBV-DNA阳性率为0。

T检验结果证实：MS组与正常对照组EBV-DNA阳性率有显著性差异（P＜0.01）。实验结果第24章疱疹病毒案例PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA图1MS组EBV-DNAPCR扩增结果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789第24章疱疹病毒案例图2MS组EBV-DNAPCR扩增结果Fig2AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA10-15.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174101112131415MPCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA第24章疱疹病毒案例图3MS组EBV-DNAPCR扩增结果Fig3AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA16-21.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174161718192021MPCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA第24章疱疹病毒案例图4MS组EBV-DNAPCR扩增结果Fig4AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA22-26.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174（25：negative）2223242526MPCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA第24章疱疹病毒案例图1MS组EBV-DNAPCR扩增结果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789PCR法检测脑脊液（CSF）中EBV-DNA第24章疱疹病毒案例

3.光镜结果

对照组的神经组织病理检查未见异常,这与此组未出现临床症状吻合。实验组动物大体脑组织可见脑膜血管充血,珠网膜下腔轻度混浊,脑横切面可见呈针尖状的小血管充血,弥漫分布。MS动物的组织病理学变化主要表现为急性血管炎伴周围髓鞘脱失,脊髓实质内、珠网膜下腔及侧脑室脉络丛小血管充血,管周有大量炎细胞浸润,形成“袖套”(cuffing)状改变(图1),发病初期主要为中性粒细胞浸润,继之以淋巴细胞浸润为主并有少量单核细胞。实验结果第24章疱疹病毒案例

Knobler等原位组织化学检测显示:

病变部位浸润的淋巴细胞以辅助T淋巴细胞和巨噬细胞/小胶质细胞为主,而细胞毒性T淋巴细胞/抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞罕见,小血管管壁增厚,管周间隙有浆液渗出。病灶播散在CNS白质内,病灶均累及小静脉,有的小静脉破裂,周围少量出血,可见白细胞附壁或正通过管壁,或进而游出血管向炎性区移动。脑膜和脊髓膜亦有炎细胞浸润。侧脑室旁白质尤其侧脑室角周围白质及脊髓后联合、侧角髓鞘肿胀,崩解消失,轴突肿胀,偶有轴突消失(图2),并可见大量格子细胞存在。神经元细胞无明显改变,有的出现卫星现象。以上病理改变符合文献报道。第24章疱疹病毒案例

图1血管周围炎性浸润

Fig1

Inflammatoryinfiltrationaroundbloodvessels×10×15×20×40第24章疱疹病毒案例图2白质脱髓鞘

Fig2

Demyelinationinwhitematter第24章疱疹病毒案例

4.电镜结果

电镜下观察MS发病动物,病变分布不规则,脱髓鞘改变以血管周围明显,大部分髓鞘环形结构呈松散状