浙科版高考生物一轮复习热点练8新情境下细胞工程的综合应用课件

热点练(八)新情境下细胞工程的综合应用123451.(2024浙江稽阳联谊学校联考)番茄中含有丰富的番茄红素,具有较高的营养价值,科研人员拟将抗寒基因(目的基因)转入番茄红素高表达番茄的核基因组中,培育具有抗寒性状的番茄红素高表达番茄,且研究抗寒基因的导入是否影响此番茄中番茄红素的高表达。其基本过程包括目的基因的获取并形成重组DNA、将重组DNA导入农杆菌、受体材料的消毒、转化番茄细胞、番茄细胞大量培养及番茄红素的检测、植株再生和抗寒性状的鉴定等。回答下列问题。12345(1)为了获得目的基因,根据

的原理,在冰川冻土中寻找具有目的基因的细菌,提取并分离出抗寒基因;选用限制酶和DNA连接酶切割并连接形成重组DNA。限制酶选择的依据有哪些?

。A.目的基因不能破坏B.质粒上复制起点不能破坏C.酶切后的黏性末端能互补连接D.只能选择一种限制酶进行切割(2)将重组DNA导入农杆菌,并将受体菌接种在

(填“含”或“不含”)抗生素的培养液中,置于

上慢速培养一段时间,使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态,便于筛选。

生物与环境相适应ABC含摇床12345(3)取番茄的幼嫩叶片,经自来水冲洗,先用75%酒精浸泡,再用

浸泡,最后用无菌水冲洗,作为转基因的受体材料。

(4)将消毒后的番茄叶片剪成小片,在导入目的基因的农杆菌溶液中浸泡后,取出并转移至添加有

的MS培养基,使小叶先脱分化形成愈伤组织,适度分化形成特定的番茄细胞并大量培养,提取并检测番茄红素的含量,从而确定抗寒基因的导入是否影响番茄红素的高表达。能影响细胞的生长速率和产物合成的因素有

(至少答出两点)。

10%次氯酸钠溶液适当配比的植物生长调节物质温度、pH、营养成分等12345(5)为了培育成植株,可将愈伤组织先后转移至发芽培养基和生根培养基,进一步发育形成完整植株;也可将愈伤组织

,提取其中的胚性细胞发育形成

,经培养可直接形成根、芽,从而快速形成试管苗。然后将上述试管苗在适宜的光照、温度和80%以上的

等条件下进行炼苗后室外大量栽培。为了鉴定

,可提取叶片组织的DNA,采用PCR扩增技术。

液体悬浮培养胚状体湿度目的基因是否导入了受体细胞12345(6)为研究转基因番茄中抗寒基因是否成功表达,可有多种方法进行验证:①取转基因番茄的体细胞,进行低温培养且

处理,再用

方法检测抗寒蛋白是否存在;

②将转基因植株和非转基因植株置于

环境中培养,若

,基本能确定抗寒的番茄培育成功。破壁(“研磨”或“破碎”)抗原-抗体杂交低温且相同转基因植株存活率明显高于非转基因植株12345解析

(1)在冰川冻土中有适应寒冷环境的细菌,依据是生物与环境相适应的原理。限制酶选择的依据是不能将目的基因切断;不能破坏质粒上的复制起点,否则质粒不能复制。酶切后的黏性末端能互补连接,否则质粒和目的基因不能连接,可以选择一种酶或产生相同黏性末端的不同酶切割,故选A、B、C。(2)将重组DNA导入农杆菌,重组Ti质粒上带有抗生素抗性基因,将受体菌接种在含抗生素的培养液中,置于摇床上慢速培养,农杆菌是好氧菌,摇床有利于提供充足氧气。(3)外植体(幼嫩叶片)需要消毒,先用75%酒精浸泡,再用10%次氯酸钠溶液浸泡,杀死部分微生物,避免杂菌污染。12345(4)农杆菌侵染后的番茄叶片,进行脱分化培养,培养时需加入适当配比的植物生长调节剂,诱导脱分化。能影响细胞的生长速率和产物合成的因素有培养基中的营养物质、温度、pH等。(5)可将愈伤组织在液体培养基中悬浮培养,提取胚性细胞发育形成胚状体,继而发育成幼苗。炼苗时,提供适宜的光照、温度和80%以上的湿度等条件。为了鉴定目的基因是否导入受体细胞,可用PCR扩增技术,进行DNA分子杂交。(6)探究抗寒基因是否表达:①将转基因番茄的体细胞低温培养且去除细胞壁,再用抗原-抗体杂交技术检测抗寒蛋白;②从个体水平检测,将转基因植株和非转基因植株置于低温且相同环境中培养,若转基因植株存活率明显高于非转基因植株,则抗寒的番茄培育成功。123452.新型冠状病毒是一种具有很强传染能力的RNA病毒。快速、准确地检测新型冠状病毒对病情的确诊尤为重要,疫苗及药物的研制等都离不开生物技术与工程的支持。(1)新冠核酸检测采用实时荧光PCR技术:通过咽拭子采集的样本转移至含病毒保存液的采样管中。病毒RNA需要经过

酶的作用生产cDNA,才能作为PCR的模板。

逆转录12345(2)效应细胞毒性T细胞能识别被感染细胞表面的

。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染,可能产生假阴性的因素有

。a.取样太早,样本中病毒量少,达不到实时荧光PCR检测阈值b.样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解c.病毒发生变异(3)利用

技术将骨髓瘤细胞和

细胞相互融合形成

细胞,此细胞生产的抗新冠病毒的单克隆抗体,不仅可以用于对患者的治疗,还能作为特异探针,利用

技术对人群进行检测。

抗原-MHC复合体abc细胞融合/电脉冲诱导/激光融合B淋巴杂交瘤抗原-抗体杂交12345解析

(1)以病毒的RNA为模板合成cDNA的过程为逆转录过程,需要经过逆转录酶的催化作用。(2)效应细胞毒性T细胞表面含有针对抗原-MHC复合体的受体,因此效应细胞毒性T细胞能识别被感染细胞表面的抗原-MHC复合体。利用实时荧光PCR技术检测新型冠状病毒的核酸,若检测到新型冠状病毒的核酸,则出现阳性反应(出现荧光标记),否则为阴性反应。取样太早,样本中病毒量少,达不到实时荧光PCR检测阈值;样本被污染,RNA酶将病毒RNA降解;病毒发生变异等都可能导致检测不到新型冠状病毒的核酸,出现假阴性的结果,因此阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。(3)利用细胞融合(或“电脉冲诱导”或“激光融合”)技术能够使骨髓瘤细胞和B淋巴细胞相互融合,二者融合后形成的细胞为杂交瘤细胞。将抗新冠病毒的单克隆抗体作为特异探针,利用抗原-抗体杂交技术对人群进行检测。123453.(2023浙江温州第三次适应性考试)水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种蛋白质,是一种优良的凝血酶抑制剂,在血栓治疗上有着重要的医学价值。已知天然水蛭素的抗凝血活性较低,产量和来源有限,某科研团队拟通过一定的技术手段改造水蛭素基因,通过制备山羊乳腺生物反应器获得活性高、产量大的重组水蛭素。回答下列问题。(1)水蛭素基因的改造:研究发现,将水蛭素的第47位天冬酰胺替换为赖氨酸,可以提高其活性。通过建立功能与结构的联系,运用

工程对水蛭素分子进行改造,从预期的水蛭素功能出发,设计水蛭素的

,推测出其氨基酸序列,再依据

推测出水蛭素基因的核苷酸序列,进而运用基因定点突变技术改造水蛭素基因。

蛋白质空间结构中心法则12345(2)水蛭素基因表达载体的构建:应用PCR技术对改造后的水蛭素基因进行扩增,在设计引物时,应在引物5'端添加特定限制酶的识别序列,其目的是

。将水蛭素基因和表达载体用

酶处理获得重组DNA分子。

便于将水蛭素基因与载体连接限制酶、DNA连接12345(3)山羊成纤维细胞的培养、转化:将无菌条件下采集制备的

(填“雌性”或“雄性”)山羊成纤维细胞悬液作为初始材料进行

培养。培养一段时间后,加入胰蛋白酶使细胞松散,当贴壁细胞趋于球形时加入过量新鲜培养液,目的是

。将带有重组DNA分子的脂质体与成纤维细胞共培养,获得含有目的基因的受体细胞。应用PCR技术可精准鉴定受体细胞中是否导入了水蛭素基因,若PCR反应出现无扩增条带的假阴性结果,可能的原因有哪几项?

(A.反应温度不适宜B.引物量不够C.模板量不够D.重组DNA未导入)

雌性原代终止酶解反应ABC12345(4)转基因奶山羊的克隆:将成功转化的成纤维细胞的核取出,移入去核的

细胞中,用电刺激后进行胚胎体外培养,将早期胚胎移植到经

处理的代孕母体子宫内,经妊娠、分娩获得转基因克隆奶山羊。(5)重组水蛭素的获取和检测:收集转基因奶山羊乳汁,从中提取得到

,分子水平上采用

技术鉴定是否含有重组水蛭素,最后使用离子交换层析实现重组水蛭素的

。卵母同期发情蛋白质抗原-抗体杂交分离(纯化)12345解析

(1)蛋白质工程是通过修改基因或创造合成新基因来改变生物的遗传和表达性状,合成新的蛋白质,通过建立功能与结构的联系,运用蛋白质工程对水蛭素分子进行改造。蛋白质工程的一般流程为:从预期的水蛭素功能出发,设计水蛭素的空间结构,推测出其氨基酸序列,再依据中心法则推测出水蛭素基因的核苷酸序列,进而运用基因定点突变技术改造水蛭素基因。(2)在设计引物时,应在引物5'端添加特定限制酶的识别序列,其目的是便于将水蛭素基因与载体连接,使水蛭素基因能正确扩增。将水蛭素基因和表达载体用限制酶(切割目的基因和载体)和DNA连接酶(连接切割后的目的基因和载体)处理获得重组DNA分子。12345(3)分析题意可知,本技术最终是通过制备山羊乳腺生物反应器获得活性高、产量大的重组水蛭素,需要从乳汁中获取产品,故应选择雌性山羊成纤维细胞悬液作为初始材料进行原代培养(分瓶前的培养);当贴壁细胞趋于球形时加入过量新鲜培养液,目的是终止酶解反应。PCR是一项通过控制反应温度实现扩增DNA的技术,若反应温度不适宜,可能出现假阴性结果,A项符合题意;PCR扩增过程中需要引物与模板通过碱基互补配对完成退火(复性)、延伸等过程,若引物量不够或模板量不够,可能出现假阴性结果,B、C两项符合题意;分析题意可知,在用PCR扩增前,已获得含有目的基因的受体细胞,不会出现重组DNA未导入的假阴性情况,D项不符合题意。12345(4)核移植技术过程中,需要将成功转化的成纤维细胞的核取出,移入去核的卵母细胞中;将早期胚胎移植到经同期发情处理(使其与供体有相同的生理状态)的代孕母体子宫内,经妊娠、分娩获得转基因克隆奶山羊。(5)分析题意可知,水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一种蛋白质,故收集转基因奶山羊乳汁,从中提取得到蛋白质;抗原与抗体的结合具有特异性,故分子水平上采用抗原-抗体杂交技术鉴定是否含有重组水蛭素,最后使用离子交换层析实现重组水蛭素的分离(纯化)。123454.(2023浙江绍兴一模)植酸又名肌醇六磷酸,通常不能被猪等单胃动物吸收,传统的做法是在饲料中添加基因工程来源的外源性植酸酶,植酸酶能将植酸中的有机磷降解为动物可吸收的无机磷,不仅可提高猪的生长效率,还能降低猪粪对环境的污染。回答下列问题。(1)培育生产植酸酶的转基因酵母时,将酵母菌与重组质粒共培养一段时间后,使用

法将培养物接种到含有特定抗生素的平板上进行筛选,再将平板上的

稀释后,分别接种到含植酸的液体培养基中进行扩大培养,选取培养基中

含量低的酵母菌种。用于酵母菌扩大培养的液体培养基,与分离所用的平板相比,最主要的差别是

。涂布单菌落植酸未加入琼脂12345(2)培育转植酸酶基因玉米时,由于农杆菌难以感染单子叶植物细胞,通常需要先使用

法制备原生质体,再进行显微注射。原生质体发育成试管苗的关键是培养基中植物生长调节物质的

。转基因玉米的果穗、秸秆可直接制成复合饲料,免去了

所需的成本。

酶解种类和配比获取植酸酶12345(3)近年来,科研人员又进行了以猪腮腺作为生物反应器生产内源性分泌型植酸酶的研究。将无菌采集的猪胚胎组织建成胚胎成纤维细胞系,长满培养瓶后的细胞需经

后转移到多个培养瓶进行传代培养。将植酸酶基因导入胚胎成纤维细胞,使用的表达载体上需要具有绿色荧光蛋白EGFP基因以及猪腮腺分泌蛋白基因的启动子和终止子,以便于

、

。收集EGFP表达阳性的细胞进行克隆,一部分细胞进行破碎后用限制酶切DNA,利用核酸分子杂交技术或PCR与

技术进行植酸酶基因鉴定,另一部分细胞用于转基因克隆胚胎构建。通过比较转基因猪和非转基因猪粪便中

,可说明转基因模型猪腮腺生物反应器的表达效率。

分离并稀释筛选成功导入重组DNA的胚胎成纤维细胞植酸酶基因在猪腮腺细胞中成功表达(凝胶)电泳磷含量12345解析

(1)酵母菌和重组质粒用液体培养基培养在一起,获得转基因酵母菌,使用涂布法将培养物接种到含有特定抗生素的平板上进行筛选,再将平板上的单菌落稀释,进行扩大培养;若转植酸酶基因成功,酵母菌合成植酸酶,会使植酸被降解,因此植酸含量低的酵母菌植酸酶的含量高,为转基因成功的酵母菌种。平板是固体培养基,需要加入琼脂,液体培养基不需加入琼脂。(2)使用纤维素酶和果胶酶可以降解植物细胞壁,获得原生质体,该方法称为酶解法。原生质体发育成试管苗用到植物组织培养技术,其中植物生长调节物质的种类和比例影响较大。转基因玉米含有植酸酶,其果穗、秸秆可直接制成复合饲料,免去了获取植酸酶所需的成本。12345(3)动物细胞培养通常会有接触抑制现象,长满培养瓶后的细胞需经分离(胰蛋白酶处理)并稀释。表达载体上需要具有绿色荧光蛋白EGFP基因,以便筛选成功导入重组DNA的胚胎成纤维细胞,启动子、终止子参与目的基因的表达。PCR可以对目的基因进行扩增,琼脂糖凝胶电泳可以检测目的基因的有无。若转基因模型猪腮腺生物反应器的表达效率较高,则植酸酶含量较高,可以将植酸中的有机磷降解为动物可吸收的无机磷,因此转基因猪粪便中磷含量较低。123455.(2024浙江新阵地教育联盟联考)某DNA病毒对动物养殖业危害十分严重。研究人员拟以该病毒抗原蛋白A来制备单克隆抗体,以期快速检测该病毒,其主要技术路线如图所示。12345回答下列问题。(1)获取基因A:用于制备蛋白A的基因称为

,获取该基因的常用方法是先建立

,用一定方法“钓取”相应基因克隆片段后通过

技术扩增,扩增的原料是

。下列对引物的叙述,错误的是

。

A.两个引物之间不应有互补性B.引物自身不存在互补序列C.引物与模板链复制起始端碱基互补D.引物的碱基包含A、G、C、U四种目的基因基因组文库PCRdNTPD12345(2)工程菌转化:将工程菌放于低温、低浓度的

溶液中,造成细胞膜通透性改变,成为

细胞,通过一定手段将外源DNA导入细胞完成转化。

(3)筛选获得杂交瘤细胞:在杂交瘤细胞筛选中,常使用特殊选择培养基如

培养基,该培养基对

和

两类细胞的存活和繁殖具有抑制作用。

CaCl2感受态HAT未融合细胞同种核融合细胞12345(4)特定杂交瘤细胞的培养和单克隆抗体的筛选:特定杂交瘤细胞培养常用搅拌式发酵罐,培养时需注意控制如

等条件(写出2点)。发酵罐中营养物质通常需加入葡萄糖、氨基酸、激素、无机盐和

,以及诱导抗体分泌的化学物质,如丁酸钠。发酵罐内细胞增殖形成

(填“细胞株”或“细胞系