(高清版)GBT 18638-2021 流行性乙型脑炎诊断技术

代替GB/T18638—2002流行性乙型脑炎诊断技术国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会 I Ⅱ 4临床诊断 2 37病毒RT-PCR检测方法 5 79血凝抑制试验检测方法 9 12病毒中和试验检测方法 附录A(规范性附录)病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制 附录B(规范性附录)补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法用试剂配制 附录C(规范性附录)补体结合试验检测方法的预备试验 附录D(资料性附录)补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图 附录E(规范性附录)间接ELISA抗体检测方法试验用试剂配制 附录F(规范性附录)间接免疫荧光试验(IFA)检测方法试验用试剂配制 IGB/T18638—2021本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替GB/T18638—2002《流行性乙型脑炎诊断技术》,与GB/T18638—2002相比，除编辑——增加了“规范性引用文件”(见第2章);——增加了“病毒中和试验检测方法”(见第12章);——增加了病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制(见附录A);——增加了补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图(见附录D);抗体检测方法试验用试剂配制(见附录E);—-—增加了间接免疫荧光试验(IFA)检测方法试验用试剂配制(见附录F)。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标准起草单位：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、温州大学、华中农业大学、吉林大学。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：ⅡGB/T18638—2021流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis)又称日本乙型脑炎，是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。马呈现脑炎症状，猪表现流产、死胎和睾丸炎，其他家畜和家禽大多呈隐性感很大的危害和损失。引起本病的病原体为流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus),该病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus),是一种单股RNA病毒，病毒粒子呈球形，有脂蛋白的囊膜，具清中和试验等方法进行诊断。我国对该病的研究报道较多，目前比较常用的诊断方法仍是本标准规定荧光试验和病毒中和试验。进行病毒分离鉴定时，要求所有样品处理应在可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2018版(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals,2018),并结合了我国相关技术研究新成果。本标准的实施，GB/T18638—2021流行性乙型脑炎诊断技术本标准规定了流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis,JE)的临床诊断和实验室诊断的技术要求。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。BBS硼酸盐缓冲液(boratebufferedsaline)CFT补体结合试验(complementfixationtest)CPE细胞病变效应(cytopathiceffect)DEPC焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTP脱氧核糖三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)ELISA酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay)FITC异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)HRP辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)JEV流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus)PBS磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline)RNA核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR反转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)TCID50半数组织培养感染剂量(mediantissuecultureinfectivedose)4临床诊断4.2.2马感染后体温升高(39℃~41℃),出现神经症状(沉郁或狂躁不安),姿势异常，走路摇晃或转—2GB/T18638—20214.3.2.3呈小胶质细胞增生反应，并呈卫星现象——假嗜神经或嗜神经。4.4.1易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判定为疑似JEV感染。4.4.2确诊应采集样品进行实验室诊断。5实验室诊断样品采集及处理5.1.2G5级玻璃滤器。5.1.6医用防护服。5.2试剂5.2.1汉克氏(Hank's)液。5.2.20.5%水解乳蛋白Hank's液。5.2.320000IU/mL青霉素液。5.2.420000μg/mL链霉素液。样品采集的生物安全措施符合GB/T18088的规定。在流行性乙型脑炎流行早期和发病早期(即病毒血症阶段),无菌采集动物的脑脊髓液，每头应不少3GB/T18638—2021于1mL,穿刺部位在两髂连线中点稍下方第七腰椎间隙。无菌采集病畜血液，每头应不少于5mL,无菌分离血清，装入离心管中，加盖密封后冷藏或冷冻保存。样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。将采集的动物脑组织或睾丸组织在组织研磨器中充分研磨，加入青霉素500IU/mL和链霉素500μg/mL,加入0.5%水解乳蛋白Hank's液，制成10%悬液，4℃浸泡3h～4h,3000r/min离心6病毒分离鉴定6.1.125cm²细胞培养瓶。6.2.17%碳酸氢钠液。6.2.21%胰蛋白酶液。6.2.31%酚红(中性)液。6.2.4最低必要成分培养液(MEM)。6.3.1清洁级BALB/c小鼠(6g～8g)。4GB/T18638—20216.3.4非洲绿猴肾细胞系(Vero)。小鼠10只(或3日龄乳鼠1窝),用左手固定，在耳与眼之间用碘酒消毒，右手持吸取接种样品的0.5mL注射器在消毒部位刺入6.4.1.3盲传：若接种小鼠(或乳鼠)第一代96h后未见发病症法将小鼠(或乳鼠)脑组织制成1:5组织悬液，按6.4.1.1所述方法再次接种小鼠(或乳鼠)。如此盲传3代。6.4.2.1制备单层细胞：按常规法将传代细胞(BHK-21、Vero或C6/36)分装在25cm²细胞培养瓶中，每瓶分装细胞悬液5mL,细胞浓度应为2×10⁵个/mL～3×10⁵个/mL,37℃培养48h。6.4.2.2接种细胞：5.3.2中采集的脑脊髓液和5.4.2中制备的上清液，或6.4.1.4中制备的鼠脑组织样本离心后取上清液，接种BHK-21、Vero或C6/36传代细胞。每份样品接种2瓶细胞，另设对照细胞2液洗1次，再加入4mL细胞维持液。对照细胞不接种样品，倒去营养液后加4mL细胞维持液，37℃6.4.2.3观察和记录：若被检样品中含有JEV,通常在接种2d～3d后出现CPE,主要呈现细胞萎缩、6.4.2.4盲传：如接种细胞第1代72h后未出现CPE,收获细胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接种生长48h的单层细胞进行盲传，即1mL第1代细胞/病毒液加4mL细胞维持液，37℃培养。如此盲传3代。对发病死亡的小鼠(或乳鼠)和出现CPE的细胞培养液，选用病毒RT-PCR检测方法(第7章)通过核酸鉴定和分析进行病毒鉴定。6.6.1小鼠(或乳鼠)盲传3代无发病症状，细胞盲传3代未见细胞病变，且经6.5所述方法检测阴性5GB/T18638—20216.6.2对发病死亡小鼠(或乳鼠)和出现CPE的细胞培养液，经6.5所述方法检测阳性者，判定为JEV7病毒RT-PCR检测方法7.1.2基因扩增仪。7.1.5电泳凝胶成像分析系统(或紫外透射仪)。7.1.7带盖的塑料离心管。7.1.8无RNA酶的离心管与吸头。7.1.9PCR管。7.2试剂7.2.1.2酚氯仿抽提液：苯酚-三氯甲烷-异戊醇(25:24:1)混合液。7.2.1.475%乙醇：无水乙醇(分析纯)与DEPC水按3:1配制而成。7.2.1.5DEPC水：将DEPC按0.1%(体积分数)加入双蒸馏水(ddH₂O)配制而成。7.2.2RT-PCR试剂7.2.2.110×一步RNAPCR缓冲液。7.2.2.2逆转录酶(AMV):5U/μL。7.2.2.4优化的AMVTaq:5U/μL。7.2.2.6MgCl₂:25mmol/L。7.2.3.1电泳缓冲液：50×TAE贮存液(见附录A),临用时加蒸馏水配成1×TAE缓冲液。7.2.3.4DNA分子质量标准：分子大小范围100bp～1000bp,100bp梯度。6GB/T18638—2021英砂研磨；然后加0.04mol/LPBS(pH7.4)(见附录B中B.5)制成1:5的悬液；置4℃冰箱过夜，再于提取总RNA(冰上操作),再进行定性RT-PCR,其扩增产物可作为电泳阳性对照样品。7.4.1.1在核酸提取室操作。RNA提取使7.4.1.2取n个灭菌的1.5mL无RNA酶离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每7.4.1.3每管加入600μL变性液，再分别加入被检样品、阳性对照及阴性对照各200μL,颠倒10次混7.4.1.512000r/min离心15min,弃去上清液，沿管壁缓缓加入0.8mL75%乙醇，颠倒3次～6次混—70℃冰箱保存。10×一步RNAPCR缓冲液2.5μLMgCl₂(25mmol/L)5μLRNase抑制剂(40U/μL)0.5μLAMV(5U/μL)0.5μL优化的AMVTaq(5U/μL)0.5μL扩增程序设置如下：7GB/T18638—20217.4.3.1琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，加入100mL1×TAE缓冲液中，加热融化后加5μL用适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。7.4.3.2加样：取6pL～8μLPCR扩增产物和2pL～3μL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳至少加1孔阳性样品的扩增产物作为对照。同时加DNAMarker作分子量大小对照。7.4.3.3电泳：在电压80V～100V或电流25mA～40mA条件下电泳10min。7.4.3.5DNA测序分析：将阳性样品PCR产物测序分析，验证阳性样品DNA条带是否属于流行性乙扩增产物的DNA条带为430bp,与阳性对照一致，同时阴性对照无条带；且测序分析验证为流行8补体结合试验检测方法8.1.3试管架。8.1.4水浴锅(37℃~38℃)。8.2试剂8.2.2溶血素：效价大于1:5000。8.2.3补体：取3只～5只成年豚鼠新鲜血清混合而成。8.2.41%绵羊红细胞悬液：采集适量健康绵羊抗凝血，加入2.5倍～3倍体积的阿氏液(见B.1),可放于4℃冰箱保存1个月。用时取适量绵羊红细胞悬液，加入5倍～10倍体积的生理盐水(见B.2),充分混匀，以2000r/min离心15min,弃上清液。如此洗涤3次。再加入5倍～10倍体积的生理盐水悬浮红细胞，充分混匀，以2500r/min离心15min,弃上清液，沉淀的红细胞以生理盐水配成1%红细胞悬液。8.2.5标准阳性对照血清。8.2.6标准阴性对照血清。8GB/T18638—20218.3被检样品8.3.1被检血清：应于发病早期和病后第4周各采血1次，无菌分离血清，密封装入灭菌小瓶，2℃~8℃保存或-20℃长期保存。操作过程中应避免污染，且须保证血清新鲜透明不溶血。8.3.2灭活处理：试验前应将标准阳性血清、标准阴性血清及被检血清进行灭活。灭活时间均为30min。不同种类动物灭活温度存在差异，其中豚鼠56℃,马58℃~60℃,人、猴及小鼠60℃,牛、水牛、山羊、狗、猪及仓鼠62℃,骡和驴63℃~64℃,家兔65℃。8.4.1预备试验见附录C。8.4.2.1.2将灭活后的标准阳性血清、标准阴性血清及被检血清分别进行2倍连续系列稀释。标准阳性血清稀释倍数要大于其标注效价，标准阴性血清一般作3个连续稀释梯度。8.4.2.2.1取3排小试管，每排6支，按照拟加入的抗原类型均分为3组，即流行性乙型脑炎抗原组、正8.4.2.2.2将倍比稀释的被检血清分别加入到对应的小试管中，具体操作程序见表1。8.4.2.2.3于各稀释度的血清中分别加入0.1mL抗原，即流行性乙型脑炎抗原、正常对照抗原、钙镁溶液。8.4.2.2.4于各管中加入补体0.2mL。8.4.2.2.737℃水浴感作30min,而后对结果进行判定。表1试验组滴加法试管号123456被检血清血清稀释度加入量/mL流行性乙型脑炎抗原(或正常对照抗原、钙镁溶液)加入量/mL补体加入量/mL第一次感作4℃冰箱过夜致敏绵羊红细胞量/mL第二次感作37℃水浴30min结果判定示例十十十十十十十十十十十士十一9GB/T18638—20218.4.2.3.1标准阳性血清：按照8.4.2.2操作进行。8.4.2.3.2标准阴性血清：按照8.4.2.2操作进行。8.4.2.3.3血清抗补体稀释对照：按照表2操作进行。8.4.2.3.4红细胞对照：按照表2操作进行。8.4.2.3.5抗原对照：按照表2操作进行。8.4.2.3.6补体对照：按照表2操作进行。表2对照组滴加法对照组别不同稀释度血清抗补体对照红细胞对照抗原对照补体对照血清加入量/mL抗原加入量/mL稀释液加入量/mL补体加入量/mL第一次感作4℃冰箱过夜致敏绵羊红细胞量/mL第二次感作37℃水浴30min结果判定示例十十十十十十十十十十十十十十十一十十十十一8.5结果判定8.5.1判定标准：各对照组结果均成立时方可进行结果判定，否则应考虑重新采集血液或改用其他方法。各对照组结果如下：a)标准阳性血清：抑制溶血，结果与已知效价相差±1个滴度；b)标准阴性血清：100%溶血(一);c)血清抗补体对照组：100%溶血(一);d)红细胞对照组：不溶血(十十十十);e)抗原对照组：不溶血(十十十十);f)补体对照组：50%溶血(十十)。8.5.2结果表示方法见C.3.2。血清效价以50%抑制溶血(++)为判定终点(溶血判定示意图见图D.1)。8.5.3结果判定：患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上，可诊断为JEV感染病畜。单份血清抗体滴度1:16以上，结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜。1:4可作为马骡感染的最低抗体滴度，重复试验仍达到1:4,结合临床症状，可诊断为JEV感染病畜。9血凝抑制试验检测方法9.1器材9.1.196孔V型微量血凝板。9.1.2多通道与单通道可调移液器及加样头。GB/T18638—20219.1.310mL无菌注射器。9.1.6普通低速离心机。9.1.7离心管。9.2试剂9.2.10.4%牛血清白蛋白pH9.0硼酸盐缓冲液(BBS):见B.4。9.2.2pH6.4的磷酸盐缓冲液(PBS):见B.5。9.2.325%的白陶土悬液：见B.6。b)加入高压灭菌过后的PBS至2mL,用1mL移液枪轻轻将鹅红细胞吹匀，500r/min,4℃离心弃上清液。重悬离心3次。放置于4℃冰箱备用。d)用1mL吸管在红细胞泥中吸取所需的红细胞，用pH6.4PBS配制8%的红细胞悬液，余下的红细胞泥放置于4℃冰箱备用。e)使用pH6.4PBS,将其作24倍稀释，制成0.33%的工作浓度的鹅红细胞悬液。此红细胞悬液在4℃冰箱中储存时间最长为三周。在使用前，轻轻重悬红细胞，再用于血凝抑制试验。取上清液，以鹅的红细胞测定其血凝效价。用含0.4%牛血清白蛋白(BSA)的pH9.0硼酸盐缓冲液(0.4%BBS)将JEV稀释至8个血凝单位，4℃保存备用。c)室温作用20min,间歇振摇。1000r/min,4℃离心30min,上清液即为10倍稀释的血清。鹅红细胞能充分吸附血清中非特异性的凝血因子，冰浴或4℃放置20min。800r/min,4℃离心10min,上清液即为处理好的待检血清(1:10)。9.3.1在96孔V型板第2行至第8行滴加4%的BBS25μL/孔(按照表3操作进行)。9.3.2在第1至11列的第1、2、8孔滴加处理好的血清25μL/孔，第2孔倍比稀释至第7孔，弃去25μL(按照表3操作进行)。9.3.3在第1至11列各孔加25μL8个血凝单位的乙脑病毒。第12列的第1、2孔加8个血凝单位的病毒，从第2孔倍比稀释到第7孔，第8孔作为阴性对照孔；第12列的第1至第8孔各加25μL4%BBS,使整块板的反应体积达到50μL/孔。盖上96孔板塑料盖，将血凝板放置于室温20min～30min(按照表3操作进行)。9.3.4轻轻摇匀PBS稀释好的鹅红细胞悬液，每孔加入鹅红细胞50μL,盖上96孔板塑料盖，再置室温作用30min～45min或过夜后判定结果。GB/T18638—2021表3微量血凝试验孔号123456789病毒稀释度1:2→1:4→1:8→1:16→1:32→1:64→对照生理盐水加入量/mL病毒液加入量/mL0.5%红细胞加入量/mL弃液体量/mL结果观察十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十十——9.4结果判定9.4.1判定标准9.4.1.1100%凝集(十十十十),呈薄膜状，凝集颗粒均匀分布整个孔底。9.4.1.275%凝集(十十十),孔底有红细胞呈滴状，周围已形成膜状。9.4.1.350%凝集(十十),血滴周围有凝集颗粒，不呈膜状。9.4.1.425%凝集(十),血滴周围仅有少量凝集颗粒。9.4.1.50%凝集(一),呈圆滴状沉淀于孔底，无凝集颗粒。参考判定标准(示意图见图D.2),患畜血清HI效价达到1:16,同时50%红细胞发生凝集，判为JEV抗体阳性。10间接ELISA抗体检测方法10.1.1酶标仪(含630nm滤光片)。10.1.2恒温孵育箱。10.1.3多通道连续移液器(规格300μL)。10.1.5精确单道移液器(规格0.5μL～10μL、10μL～200μL和1mL～10mL)。10.1.6多道移液器(规格30μL～300μL)。10.1.7U底8×12孔血清稀释板。GB/T18638—202110.1.9V底型加样槽。10.1.10量筒(规格100mL和2000mL)。10.1.12一次性PE手套。10.2.6底物液A,见E.6。10.2.7底物液B,见E.7。采集动物血时，每只动物使用一个注射器。建议进行前腔静脉或耳静脉无菌采血，不少于2mL。室温静置于斜面2h,待血液自然凝固后，置2℃~8℃冰箱中放置不少于2h,800r/min,4℃离心血清样本若在一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，应置-20℃以下冷冻10.4.1JEV灭活抗原JEVSA14-14-2于单层BHK细胞上增殖，经甲醛灭活后离心除去细胞碎片，收集上清液后采用硫酸铵法对病毒进行浓缩，浓缩的病毒作为试验用抗原。采用方阵滴定方法，选应的抗原稀释度作为最终的使用浓度。10.4.2HRP标记羊抗被检动物IgG将其用PBST稀释至最适浓度。同待检血清一起作同样稀释。10.5操作程序10.5.1抗原的包被：将灭活浓缩的乙脑病毒用包被液稀释后加到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃放置拍干，共计洗涤3次。10.5.3封闭：加入封闭液100μL/孔，置37℃下温育1h。10.5.5加入待检血清：将待检血清、阴性对照血清及阳性对照血清用血清稀释液按照1:40稀释，将已稀释血清各取100μL加至抗原包被板中，待检血清设1孔，阴、阳性对照各设2孔。轻轻振匀孔中样10.5.6洗涤：方法同10.5.2,共计洗涤5次。10.5.7加酶标二抗：每孔加羊抗被检动物酶标二抗100μL,置37℃下温育30min。10.5.8洗涤：方法同10.5.2,共计洗涤5次。10.5.9加底物：每个反应孔加入底物液A1滴(约50μL)和底物液B1滴(约50μL),混匀，置室温避光显色10min。10.5.10加终止液：待显色结束后每个反应孔中加入终止液1滴(约50μL),10min内测定结果。10.5.11结果测定：在酶标仪上采用630nm处的吸光光度值(OD₆30nm值)测定检测结果。10.6结果判定值均应<0.2。计算样品的抗体阳性；若S/P值<0.21,判为被检动物JEV抗体阴性。11间接免疫荧光试验(IFA)检测方法11.1器材11.2试剂11.2.2阴性和阳性血清。11.2.3待检血清。11.2.4缓冲甘油(见附录F中F.1)。11.2.5异硫氰荧光素(FITC)标记抗被检动物IgG(按说明稀释使用)。11.3操作程序11.3.1感染细胞的制备用含5%胎牛血清的DMEM培养基在37℃和5%CO₂环境中培养BHK-21细胞。待细胞长满单GB/T18638—2021层时接种JEVSA14-14-2株，并换成含2%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养36h～48h。11.3.2.1细胞病变(细胞圆缩、破裂)约达60%～80%时，收集细胞培养物，以1500r/min离心10min,弃上清液，用PBS洗涤细胞沉淀物3次，用PBS重悬细胞。11.3.2.3吹干滴好的抗原片，用4℃预冷的丙酮固定10min,保存于-20℃,一周内使用。11.3.3.1取出抗原片室温放置10min待用。11.3.3.2用PBS将待检血清、阴性血清及阳性血清分别稀释成1:100和1:500两个稀释度，分别取11.3.3.4用PBS浸洗3次，每次10min。11.3.3.5取20μLFITC标记的抗被检动物IgG滴加于上述处理过的抗原片各孔中，孵育同11.3.3.3,11.4.3阳性对照血清：JEV感染细胞制备的抗原片中，加入阳性血清，细胞内可见清晰的黄绿色荧光颗粒。12.1.1恒温CO₂培养箱。12.1.2倒置生物显微镜。12.1.396孔细胞培养板(平底)。12.1.5多道微量加样器(10pL～100μL和30μL～300μL)及吸头。12.2.1阳性对照血清：JEV感染动物或JEV疫苗免疫动物血清，56℃水浴灭活30min。GB/T18638—2021备用。12.2.8细胞染色液：用10%福尔马林配制成0.05%亚甲基蓝溶液。12.3.1病毒增殖：在铺满BHK-21单层细胞接种JEV,置于37℃、5%CO₂恒温培养箱中孵育1h后，加新鲜细胞维持液，再置37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养，逐日观察，待CPE达到75%以上时进行病毒收获。将收集的病毒在-70℃和4℃间反复冻融3次，无菌离心(2000r/min)20min,取上清液分链霉素)及5%血清的稀释液将JEV作10-¹、10-²、10-³、10-⁴、10-⁵及10-6稀释，然后接种96孔微量板，每个稀释度接种8孔，每孔25μL,每孔再补加25μL细胞生长液。每孔加入BHK-21细胞悬液(使用浓度3.0×10⁵个/mL)50μL。同时设置8孔细胞对照，即用50μL细胞生长液+50pLBHK-21细胞悬液。将96孔细胞培养板置于12.3.3病毒工作液的配制：将待检病毒用细胞生长液稀释为每25μL含100个～1000个TCID₅o作为病毒工作液。12.3.4血清准备：阳性血清、阴性血清和待检血清经56℃30min灭活后，自1:2倍比稀释至1:32。12.4.1将10-¹、10-²、10-³、10-4、10箱内孵育1h或4℃冰箱孵育过夜。12.4.2将病毒和血清的混合液接种到96孔细胞培养板内，每组接种8孔，每孔50μL病毒和血清混合12.4.3置于37℃、5%CO₂恒温培养箱内，并连续观察细胞状态7d。12.4.4每次试验每块培养板都应设立下列对照：a)细胞正常对照：每块培养板上均设立2孔～4孔不接种病毒的正常细胞对照，每孔分别加入50μL不含病毒的培养液和50μLBHK-21细胞；b)阴性对照血清：设8孔，每孔加入1:2或1:10稀释的阴性血清和病毒混合液50μL,立即补c)阳性对照血清：设8孔，每孔加入1:2或1:10稀释的阳性血清和病毒混合液50μL,立即补12.4.5染色：7d后将96孔细胞培养板固定并作常规染色。12.5.3阳性对照血清：阳性对照血清孔12.5.4病毒对照，应保证在1000个TCID₅₀的病毒液10-¹和10-²稀释度的各个孔均出现CPE,10-3有1个～3个孔出现CPE,10-⁴有8个孔全无CPE。GB/T18638—202112.6.1细胞层染色呈蓝色为阳性孔(病毒被中和),不着色为阴性孔(病毒未被中和),以血清能够中和50%病毒时的稀释度为血清最终滴度。12.6.2被检血清最终滴度为1:4或更高者判定为阳性。12.6.3被检血清最终滴度低于1:4判定为阴性。12.6.4被检血清最终滴度在1:2和1:4之间判定为可疑，重复试验结果为1:4或更高时判定为13.1使用临床诊断(第4章)可判定流行性乙型脑炎疑似感染，使用血凝抑制试验检测方法(第9章)或间接ELISA抗体检测方法(第10章)或间接免疫荧光试验(IFA)检测方法(第11章)或病毒中和试验检测方法(第12章)可对疑似感染样品进行筛查，如需确诊，可进一步使用病毒分离鉴定(第6章)或病毒RT-PCR检测方法(第7章)或补体结合试验检测方法(第8章)。13.2使用临床诊断(第4章)可判定流行性乙型脑炎疑似感染，可使用病毒分离鉴定(第6章)或病毒RT-PCR检测方法(第7章)或补体结合试验检测方法(第8章)确诊流行性乙型脑炎病毒感染。13.3非免疫动物流行性乙型脑炎病毒抗体阳性排除母源抗体原因后可确诊曾经感染过流行性乙型脑GB/T18638—2021(规范性附录)病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制50×TAE:三羟甲基氨基甲烷(Tris)乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)冰乙酸(C₂H₄O₂)加去离子水至1000mL。242ggmLmLGB/T18638—2021(规范性附录)补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法用试剂配制B.1阿氏液(用于补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法)葡萄糖(C₆H₁2O₆)2.05g柠檬酸钠(Na₂C₆H₅O₇·2H₂O)0.8g氯化钠(NaCl)0.42g加双蒸馏水或无离子水至100mL,56kPa20min高压灭菌。B.2生理盐水(用于补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法)氯化钠(NaCl)8.5g加双蒸馏水或无离子水至1000mL,105kPa20min高压灭菌。B.3钙镁溶液(用于补体结合试验检测方法)氯化钙(CaCl₂·2H₂O)4.0g加蒸馏水至100mL,105kPa20min高压灭菌。B.40.4%牛血清白蛋白pH9.0硼酸盐缓冲液(BBS)(用于血凝抑制试验检测方法)母液I:0.05mol/L硼砂(Na₂B₄O₇·12H₂O)溶液，硼砂5.2g,加双蒸馏水或无离子水至250mL。母液：0.2mol/L硼酸(H₃BO₃)溶液，硼酸1.2g,加双蒸馏水或无离子水至100mL。使用液：母液I132mL+母液IⅡ18mL+生理盐水460mL。配制后测定pH值，如不到9.0,可加适量0.05mol/L硼砂溶液。105kPa20min高压灭菌。临用前，在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白。B.5不同pH值磷酸盐缓冲液(PBS)母液I:1/15至1000mL。母液I:1/15mol/L磷酸氢二钠(Na₂HPO4)溶液，无水磷酸氢二钠9.47g,加双蒸馏水或无离子水mol/L磷酸二氢钾(KH₂PO₄)溶液，磷酸二氢钾9.08g,加双蒸馏水或无离子水至pH5.8pH6.0PBS:母液I8.0PBS:母液I12.2mL+母液I92mL+生理盐水566mL;mL+母液Ⅱ87.8mL+生理盐水566mL;pH6.2PBS:母液I18.6mL十母液II81.4mL十生理盐水566mL;pH6.4PBS:母液I26.7mL十母液IⅡ73.3mL十生理盐水566mL;pH6.6PBS:母液I37.5mL+母液IⅡ62.5mL十生理盐水566mL;pH7.4PBS:母液I80.8mL+母液I19.2mL十生理盐水566mL。B.625%白陶土悬液(用于血凝抑制试验检测方法)取优质白陶土粉末25g,加pH7.4磷酸盐缓冲液至100mL,105kPa20min高压灭菌4℃保存，可用1个月。临用前摇匀。GB/T18638—2021(规范性附录)补体结合试验检测方法的预备试验C.1溶血素效价滴定C.1.1溶血素的稀释吸取溶血素0.1mL(含50%甘油者用0.2mL),加钙镁盐水9.9mL(含50%甘油者加9.8mL),混匀后即为1:100的溶血素，然后取1:100溶血素1mL加钙镁盐水4mL,即为1:500的溶血素。再按表C.1进行稀释。表C.1溶血素稀释液制备管号溶血素浓度溶血素量/mL溶血素稀释度溶血素最终浓度ABCDEFGHC.1.2溶血素的滴定后按表C.2依次加入补体、钙镁盐水及1%绵羊红细胞，摇匀后，置37℃水浴中30min,观察结果。表C.2溶血素的滴定管号稀释用补体浓度补体加入量/mL补体最终浓度124.03456789GB/T18638—2021能使红细胞完全溶解的溶血素的最高稀释度称为1个溶血素单位。表C.1中的G管，即0.1mL1:6000的溶血素含有1个单位。试验中应用2个单位的溶血素。即将溶血素稀释成1:3000,则0.1mL中含有2个单位溶血素。C.2补体效价滴定即1:50稀释补体。然后按表C.3的量，分别加入三排小试管中，再依次加入钙镁溶液、4个单位溶血素或1:5稀释抗原，混匀后，放37℃水浴中30min,再加入致敏绵羊红细胞(1%绵羊红细胞悬液与等量2个单位溶血素相混合，放37℃水浴中15min),摇匀后，放37℃水浴中30min,观察结果。表C.3补体效价的滴定抗原类型管号补体加入量/mL稀释抗原加入量/mL钙镁溶液加入量/mL第一次孵育致敏红细胞加入量/mL第二次孵育结果举例病毒抗原10.050.25水浴中放置37℃水浴中不溶20.080.22微溶30.100.20微溶40.120.18全溶50.140.16全溶60.160.14全溶正常脑组织对照抗原70.050.25不溶80.080.22微溶90.100.20微溶0.120.18全溶0.140.16全溶0.160.14全溶盐水对照0.050.35不溶0.08—0.32微溶0.100.30微溶0.120.28全溶0.14—0.26全溶0.160.24全溶C.2.2补体稀释倍数的计算：能使红细胞完全溶解的最小补体量为一个单位，正式试验和抗原滴定时都用2个补体单位。计算方法如下：0.12mL的1:50补体为1个单位，2个单位补体应为0.24mL的1:50补体。补体稀释倍数以