可见和紫外分光光度法

第十三章可见和紫外分光光度法本章教学要求本章教学要求生疏吸取光谱、透光率与吸光度了解分光光度法及其分类分光光度法(spectrophotometry)是一种现代仪器分析方法，它是利用物质的为可见分光光度法；10nm~380nm为紫外分光光度法(200nm~380nm)；780nm~3105nm为红外分光光度法。可见-紫外分光光度法通过测定物质对特定波长光的吸取，求出物质的含量10-3molL-1～10-6mol•L-1；相对误差虽比滴定分析大，但对微量分析而言，确定误差微小含量及争论生化过程等。本章主要学习可见-紫外分光光度法根本原理和方法。——吸取光谱和朗伯－比耳定律一、吸取光谱的产生与吸取曲线〔一〕原子光谱和分子光谱12当原子中的电子吸取或释放肯定能量后将从一个能级(E)轨道跃迁到另一个能级(E)轨道上，吸取或释放的能量可以是具有肯定波长的光。产生的与跃迁前后两个能级的能量差有关12 c hc hc hc

E

E E2 1h为普朗克常量；c为光速；为频率。此类性质的分析法称为原子光谱法。eE、分子振动能级的能量eEE。在每一电子能级上有很多间距较小的振动能级，v rE约e区的分子吸取光谱的分析方法称为可见-紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry,VIS-UV)。由于可见-紫外吸取光谱主要产生于价电子在电子能级间的跃迁，所以也将其称为电子光谱方法。振动能级间的能量差E约为v0.05eV～1eV，相当于红外光的能量。而转动能级间的能量差Er

eV～是带状光谱。测定。红外光谱常用于争论有机化合物的结构。〔二〕吸取光谱将不同波长的单色光依次通过被分析的物质溶液，分别测得不同波长下的吸取程度，吸光度(absorbance)A为横即为吸取光谱(absorptionspectrum)13-1KMnO4的吸取光谱。吸取光谱中，吸光

图13-1max表示〔13-1max525n。图525nm。溶液浓度愈大，吸取光谱的峰值愈高，两者成正比关系。假设承受最大吸取波长测定吸光度，则灵敏度最高〔响应值随浓度的变化幅度最大，所以一般定量测定时选择max波长作为入射波长。吸取光谱表达了物质的特性，是进展定性、定量分析的根底。二、透光率和吸光度0at s I的单色光通过溶液时，一局部能量被吸取I，一局部透过溶液样品混浊或辐射荧光，则透射光中还包括样品的散射光〔I〕和荧光〔I，见图0at s 和参比溶液分别置于两个同样材料和厚度图sr I和散Isr 0 a I=I +I 0 a 透射光强度I〔transmissionintensity〕与入射光强度I(incidentintensity)之比t oT表示T=It (13-2)I0多。AAA=-lgT=lgI0 (13-3)It吸光度与溶质、溶剂、波长、温度、浓度及液层厚度等因素有关。三、朗伯－比耳定律1729年法国科学家布给(P.Bouguer)1760年德国科学家朗伯(J.Lambert)时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比，即1A=kb (13-4)11溶液浓度及温度有关。朗伯定律对全部的均匀介质都是适用的。1德国科学家比耳(A.Beer)于1852年依据一系列的试验证明：当肯定波长的单色光通过溶液时，假设液层厚度肯定，则吸光度与溶液浓度成正比，即：2A=kc (13-5)22c为物质的量浓度(或质量浓度)，k是与吸光物质种类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。比耳定律仅适用于单色光。2(13-4)和式(13-5)，得：A=κbc (13-6)式中b的单位为cm，c(molL-1)为摩尔吸光系数(molar[”kp]Lmol-1cm-1。(gL-1)表示溶液的组成标度，则朗伯－比耳定律可表示为：A=abρ (13-7)(massabsorptivity)Lg-1cm-1。a和κ可通过下式相互换算：Bκ=aM (13-8)BBM表示被测物质的摩尔质量。B吸光系数κ(a)随不同的物质、波长、溶剂及温度而异，所以它可以表示愈大，max测定。通常所说的吸光系数也指的是在吸取光谱中max

时的κ。)之间为正比关系，而透光率与溶液浓度(或液层厚度)之间为指数函数关系：-lgT=κbcT=10-κbc (13-9)在化合物组成不明的状况下，物质的相对分子质量无从知道，物质的量浓度100mL溶液中含被测物质1g，液层厚度b1cm时的吸光度E1%1cm

表示，它与a的关系为：a0.1E1%1cm

(13-10)14-1】朗伯－比耳定律计算Fe2+1.810-5molL-1Fe2+显色*2.0cm508nm处测得A=0.38，计算摩尔吸光系数。【解】κ=A=

0.38

=1.1104Lmol-1cm-1bc 2.0cm1.8105molL1κ，测定的灵敏度就愈高。κ与溶液的浓度及液层厚度无关。其次节可见-紫外分光光度法一、可见及紫外分光光度计(13-3)。图〔一〕辐射光源(lightsource)在所需光谱区域内能放射连续的具有足够强度和稳定的辐射光，并且辐射能随波长的变化尽可能小，使用寿命长。320nm~2500nm。165nm~350nm范围内发出连续光200nm~350nm。〔二〕单色器(monochromator)是从光源辐射的复合光中分出单色光的装置。最常用的色散元件有棱镜和光栅。光区。光栅的区分率在整个光谱范围内是均匀的，使用起来更便利。〔三〕吸取池可见及紫外分光光度法中，将被测液体放在分光光度计光束通过的液体池中，用来盛放溶液的容器称为吸取池(absorptioncell)。可见光区的吸取池用一般10-2cm~10cm或更厚，0.5cm、1cm、2cm，视分析需要选用。〔四〕光敏检测器分光光度计中的光敏检测器(photosensitive detector)一般用光电管(photoelectriccell)，当光照耀到阴极时，外表金属放射电子，流向电位较高的阳生光电流。光愈强，阴极外表放射的电子愈多，产生的光电流也愈大。光电管因敏感的光谱范围不同而分为蓝敏和红敏光电管两种前者可用波长范围为210nm~625nm，而后者可用范围为625nm~1000nm。谱的精细构造有较好的区分力量。强度呈线性响应，响应快，高稳定和低“噪音”水平。二、测定方法及应用测物质含量。(一)标准曲线法的方法：取标准品配成一系列浓度的标准溶液，在选定波特长(通常为max)，图13-4在标准曲线的线性范围内。承受空白溶液(blanksolution)作比照。在可见光区常用的空白溶液有以下三种：液。试剂空白假设显色剂有色，试样溶液在测定条件下无吸取或吸取很小时，(不加被测试样溶液)后所得溶液，相当于标准曲线法中浓度为“0”的标准溶液。试样空白当试样基体有色如试样溶液中混有其它有色离子不加显色剂但按显色反响一样条件进展操作的试样溶液。(二)标准比照法s x s (c表示)处测AAs x s cxAxcAs s

(13-11)此方法适用于格外常性的分析工作。(三)比吸光系数比较法E1%1cm

值进展定量测定的，我国药典(2023年版)中规定某些药物的测定一般承受此法。马上样品的比吸光系数与标准物质的比吸光系数(可从手册上查得)比较，计算出样品含量(质量分数或体积分数)。例如：广谱抗菌药呋喃妥因的E1%1cm

(367nm)=746，在一样条件下，测定呋喃妥因样品的E1%1cm

(367nm)=738，因此，该样品中呋喃妥因的质量分数为7380.9893。746(四)差示分光光度法(differentialspectrophotometry)1希斯金(Hiskey)提出：用浓度的标准溶液c〔应与它的待测样品浓度相近〕作参比112溶液调零，然后测定同种未知浓度c2样品的吸光度，可以削减相对误差。差示法测定的是两者浓度之差2-1，假设测定误差为%，差示法所测得结果是2-c，非c2c·x%，明显差示法相对误差较小。12AAxAs的差值：x s x A=(A-A)=b(c-c)=bx s x 式(13-12)A与c成正比，据此，即可计算试样溶液的浓度。在实际操作中配置一度的标准曲线。最终从标准曲线上得出待测样品的浓度。设按一般分光光度法测得的某标准溶液的透光率为10=1，其待测样品溶液的透光率为5A=1.3此时试样溶液的透光率亦被扩展为50A=0.，从而提高了测量的准确度。实际上差示法是将量程范围扩展，因此也称为扩展量程光度法〔expandedscalespectrophotometry。但差示吸取光度法也不是无限度的应用，它还受到仪器本身灵敏度及测量噪音的限制。三、测定误差的分析源不稳定及读数不准等因素引起的。它使测得的透光率T与真实值相差T，从c。由朗伯－比耳定律可推导得出浓度的相对误差与溶液透光率的关系式为：

0.434T

(13-13)c TlgT一般分光光度计由于读数区分率引起的透光率测量误差T一般约为0.01~。假设T0.01T值代(13-5)。图13-520%~65%(A为：0.2~0.7)时，所产生的浓度相对误差36.8%(A=0.434)时所产生的浓度相对误差最小。在实际工20%~65%0.2~0.7之间。需要特别说明的是浓度测量误差既依靠透光率T的读数区分率，又依靠其它多T2.00.02厂家，以增加试验数据的牢靠性。*阅读资料：第三节原子吸取分光光度法一、原子吸取分析进展史在1802年乌拉斯顿(Wollaston)观看到太阳光谱中存在着很多暗线，但是不能解释暗线的本质。直到1859年克希霍夫〔Kichoff〕和本生(Bunsen)在争论火焰中的光谱时，确定了2030测汞困难大，所以人们利用原子吸取光谱的原理设计了测汞仪。瓦尔什〔Walsh〕提出了原子吸取光谱作为一般分析方法广泛应用的可能性，并争论了吸光度与原子浓度之间的关系。此后，原子吸取光谱(atomicabsorptionspectrometry)作为一种分析方法才进展起来。20世纪60年月后，进展了非火焰原子吸取—石墨炉，使原子吸取分析的元素范围和灵敏度到达了阶段。二、原子吸取分析工作原理〔空心阴极灯II，透过0T=I/I，II符合朗伯-比耳定律：0 0=I IeKNL=0KN为自由原子总数〔近似于基态原子数L为吸取层厚度。A=-lgT=lgI0=0.4343KNLI此式说明，AN成正比。在实际分析过程中，当试验条件肯定时，Nc。因此，以标准系列做出工作曲线后，即可依据吸光度的大小，求得待测元素的含量。三、原子吸取分光光度计图原子吸取分光光度计由光源、原子化器、单色器、检测器四个主要局部组成〔13-6所示。光源：使用广泛的是空心阴极灯hollow-cathodelam，它是一种阴极呈空心圆柱性气体〔氖或氩，在两极间加100-400V的线光谱，光束强度大。原子化器(atomizer)射光束在这里被基态原子吸取。因此，它可视为“吸取池火焰原子化器(flameatomizer)：是将液体试样经喷雾器形成雾滴，这些雾滴在雾花室中与气体〔燃气和助燃气〕均匀混合，再进入燃烧器形成火焰。此时，试液便在火焰中产生原子蒸气。非火焰原子化器：广泛应用的是石墨炉(graphitefurnace)。单色器单色器(monochromator)的作用是将灯放射的被测元素的共振线与其它波长辐射分开。检测系统检测器(detector)。沟通放大，读数装面积积分法进展测定。四、定量分析方法标准曲线法：配制一系列适宜浓度的标准溶液，由低到高浓度依次喷入火焰，分别A,A为纵坐标，被测元素浓度〔或含量〕c为横坐标，绘制标准曲线。在一样条件下，喷入被测样品，测定其吸光度，在标准曲线中求得样品中被测元素的浓度或含量。标准参加法：当样品基体影响较大，又没有纯洁的基体空白或测定纯物质中极微量的元素时，可以承受此方法。分别