(高清版)GBT 40140-2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

GB/T40140—2021葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40140—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波海关。1GB/T40140—2021葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法本文件适用于葡萄上葡萄轴枯病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。本文件没有需要界定的术语和定义。4葡萄轴枯病菌的分类信息病原学名及中文名：Alternariaalternata(Fr.)KeiSacc.、Alternariatenuisf.genuinaUnamuno、Alternariatenuisf.trichosanthisD.Sacc.、Alternaritenuisvar.maliMarchal&.É.J.Marchal、MacrosporiumfasciculatumCooke&.Ellis、TorulaalternataFr.分类地位：真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,座囊菌纲Dothideomycetes,格孢腔菌目Pleospo-rales,格孢腔菌科Pleosporaceae。葡萄轴枯病菌的其他信息见附录A。依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性，根据该真菌6.1试剂和材料2GB/T40140—2021材料包括：植物基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、TaqMan荧光PCR反应试剂盒、50×TAE电泳缓冲液。6.2培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA),具体配方的信息见附录B。7仪器和用具生物显微镜(放大倍数400倍以上)、体视显微镜、二次纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作7.2用具8检疫鉴定方法8.1症状检查与病害症状观察葡萄果穗分枝穗轴部位是否有变褐干枯，果粒是否失水萎蔫，表皮是否有褐斑或霉状物。病害症状主要在幼穗的分枝穗轴上，初期有褐色水浸状斑点，后向主穗轴扩展形成褐色病斑，穗轴萎缩干枯。湿度大时病斑上可见黑色霉层，即病菌菌丝、分生孢子梗、分生孢子链和分生孢子。病害症状见图A.1。8.2分离培养将葡萄穗轴用流水冲洗干净，在穗轴的病健交界处切取0.5cm～1.0cm左右的小段，用1%次氯酸钠消毒5min,无菌水冲洗3次，置于灭菌滤纸上吸去表面水分，放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)或带三层无菌湿滤纸的培养皿上，在25℃下，两支40W灯管(色温4200K)12h光照、12h黑暗交替培养3d～4d,灯管距离培养物约40cm。有疑似菌落的培养皿置于体视显微镜50×下观察，用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子链上的单个孢子，转接于马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)上，在22℃下，两支40W灯管(色温4200K)8h照射和16h黑暗交替进行培养，灯管距离培养物约40cm,培养物面向上，1周后观察。8.3形态学鉴定8.3.1培养物观察与测量将上述培养物在体视显微镜50×下观察分生孢子梗产生的分生孢子和分生孢子链的特征(产孢表量分生孢子和喙胞的大小各30个。3GB/T40140—2021棍棒状，呈淡褐色至暗褐色，表面光滑或具微刺；成熟时具2个～8个横隔膜，1个～4个纵、斜隔膜；分生孢子一般2个～8个串生在一起，单生较少，大小(17.5μm～40.0μm)×(5.0μm～12.5μm),平均产孢细胞，可二次分枝或产孢。形态图见附录A中A.4。8.4分子生物学鉴定8.4.1DNA提取将分离的疑似病菌收集，放入浸在液氮里的1.5mL离心管中，用一次性塑料杵碾碎，按照CTAB法或植物基因组提取试剂盒提取DNA。DNA提取方法按照附录C操作。8.4.2常规PCR检测采用特异性引物AaltFor/AaltRev,按照附录D进行常规PCR检测。8.4.3实时荧光PCR检测采用实时荧光PCR特异性引物OPAF/R和TaqMan探针OPAP,按照附录E进行实时荧光PCR检测。9结果判定病害症状和分离物的形态特征与8.1和8.3描述的一致，且常规PCR特异性引物扩增结果符合附录D为阳性或实时荧光PCR检测结果符合附录E为阳性，可判定为检出葡萄轴枯病菌。10样品和档案保存10.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。检出葡萄轴枯病的样品经登记签字，保存于4℃冰箱中，至少保存6个月以备复核，保存期满后应经高压灭菌后方可处理。对不需要长期保存的染病材料应及时高压灭菌处理。10.2结果记录与资料保存和审核人员签字。4GB/T40140—2021(资料性)葡萄轴枯病的其他信息A.1危害情况葡萄轴枯病也叫葡萄穗轴褐枯病，发病一般在开花前后。主要危害葡萄幼嫩的穗轴，使穗轴变褐枯传播途径：病菌以分生孢子在葡萄枝蔓表皮以及在病残体越冬，为翌年初侵染来源。葡萄开花前至开花期为病菌的主要侵染时期，以分生孢子通过伤口或自然孔口侵入幼穗穗轴的表皮组织。病菌近距离传播主要靠染病穗轴上的分生孢子和农事操作，远距离传播主要靠葡萄贸易。葡萄轴枯病在我国一些葡萄产区有分布，多雨或空气湿度大的地区和年份发生较多。严重时，发病穗率可达20%～40%,导致减产10%～30%,严重的减产40%以上。该病害是新西兰和澳大利亚进口中国鲜食葡萄上关注的有害生物。A.2病原菌情况引起葡萄轴枯病的致病病原菌一直存有争议，最早国内认为葡生交链孢菌(Alternariaviticola)是致病菌，国外研究认为是由链格孢菌(Alternariaalternata)引起。近年经广泛搜集资料和采集样本，发现引起国内葡萄轴枯病的致病菌非以往报道的葡生交链孢菌(Alternariaviticola),而主要是链格孢菌(Alternariaalternata)。A.3病害症状葡萄轴枯病菌病害症状见图A.1。图A.1葡萄轴枯病菌病害症状A.4病菌形态特征葡萄轴枯病菌分生孢子链和分生孢子见图A.2。5a)分生孢子链b)分生孢子6GB/T40140—2021(资料性)B.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)20g,琼脂粉17g,加蒸馏水补足至1000mL,121℃高压灭菌20min。B.2马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)加入琼脂粉17g,加蒸馏水补足至1000mL,121℃高压灭菌20min。7GB/T40140—2021(规范性)DNA提取C.1.1十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)DNA提取缓冲液十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)4g,乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O,0.5mol/L)8化钠(NaCl)16.4g,1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)20mL,巯基乙醇(C₂H₆OS)4加蒸馏水定容至200mL,调pH至8.0,121℃高压灭菌30min。mL,氯mL,C.1.2蛋白沉淀液蛋白沉淀液由Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇三种溶液以25:24:1的体积比进行配制，置于C.2DNA提取步骤挑取菌丝约0.1g,用灭菌滤纸吸干水分，放入1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杵碾碎待用。或将病组织0.1g～0.2g,在灭菌研钵中，加入液氮研磨后，放入1.5mL离心管中，待用。离心管中加入300μL～500μLCTABDNA提取缓冲液和0.1g蛋白酶K,混匀，65℃水浴1h,12000r/min离心5min,保留上清液。饱和酚：三氯甲烷：异戊醇(体积比为25:24:1)混匀，12000r/min离心5min。饱和酚：三氯甲烷：异戊醇(体积比为25:24:1)轻摇混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1mL异丙醇混匀，-70℃下放置1h,或-20℃过夜；12000r/min离心30min,可见DNA沉淀。弃去上清液，70%乙醇洗DNA沉淀2次，室温干燥后，用30μL～50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA,待用。用微量分光光度计测量DNA浓度，A₂6o/A₂s₀比值应接近1.8。8常规PCR检测方法D.1引物序列引物系列见表D.1。引物名称引物序列(5'-3扩增片段长度AaltForGTGCCTTCCCCCAAGGTCTCCGAaltRevCGGAAACGAGGTGGTTCAGGTCD.2PCR扩增0.2mLPCR管中，包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL,引物各1.0μL(10在1×TAE电泳缓冲液中，2%琼脂糖凝胶电泳，5V/cm,0.5%核酸染料染色20min,凝胶成像仪分析结果。如果阳性对照及检测样品出现约184bp的条带，阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阳性。如果阳性对照出现约184bp的条带，检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带，可判定样品为葡萄轴枯病菌阴性。9GB/T40140—2021(规范性)实时荧光PCR检测方法引物和探针序列见表E.1。表E.1实时荧光PCR引物序列和探针引物和探针引物序列(5'-3′)TCACTACAGACCAAATCCCTTCCTACATCTCAAATGCCAAATATCTTCTCACGTCGGGCCCCTGAE.2实时荧光PCR反应体系离心管中加入2×TaqManUniversalPCRMasterMix10μL,OPAF20μL。设置阳性对照、阴性对照注：PCR反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当调整，也可采用等效试剂盒。E.3结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值≤30并出现典型扩增曲线的条件下：待测样品的Ct值≤35时，判定葡萄轴枯病菌阳性；待测样品的Ct值≥40时，判定葡萄轴枯病菌阴性；待测样品的35<Ct值<40时，重新测试；增加DNA用量2～10倍再次测试，待测样品出现典型扩GB/T40140—20212013,34(20):170-173.[5]BaslmE.,BaslmH.,AbdulaiM.,BakiD.,ÖztürkN.IdentificationaAlternariaalternatacausingleafspotofolivetree(Oleaeuropaea)inTurkey[J].CropProtection,2017,92,79-88.[6]KantR.,JoshiP.,BhandariM.,PandeyA.,PandeyS.IdentificationandpathogenicityofAl-ternariaalternatacausingleafspotandblightdiseaseofAilanthusexcelsinIndia[J].ForestPatholo-gy,2020,DOI:10.1111/efp.12584.[7]KonstantinovaP.,BonantsP.J.M.,vanGent-PelzerM.P.E.,vanderZouwenP.,vandenBulkR.DevelopmentofspecificprimersfordetectionandidentificationofAlternariaspp.inc