GB∕T 30737-2014 海洋微微型光合浮游生物的测定 流式细胞测定法（正式版）

海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法2014-06-09发布GB/T30737—2014 I 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 25主要仪器设备 26试剂 27样品采集与处理 38测定步骤 39结果分析与计算 4附录A(规范性附录)海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式 7参考文献 I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家海洋局提出。本标准由全国海洋标准化技术委员会(SAC/TC283)归口。本标准起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、厦门大学、国家海洋局第二海洋研究所、华东师范大学、中国科学院南海海洋研究所。1海洋微微型光合浮游生物的测定流式细胞测定法本标准规定了海洋微微型光合浮游生物中原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类细胞数量的流式细胞测定法。本标准适用于海洋微微型光合浮游生物中上述3个主要类群细胞数量的流式细胞测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T12763.6—2007海洋调查规范第6部分：海洋生物调查3术语和定义GB/T12763.6—2007界定的以及下列术语和定义适用于本文件。注：改写GB/T12763.6—2007,定义3.9。微微型浮游生物picoplankton粒径范围在0.2μm～2μm的浮游生物。注1:微微型浮游生物不是一个严格的生物学概念，而是一个生态学概念。注2:改写GB/T12763.6—2007,定义3.9。微微型光合浮游生物photosyntheticpicoplankton能进行光合作用的微微型浮游生物。注：微微型光合浮游生物又包括自养和异养两种类型，以自养型的占绝对优势。自养型的微微型光合浮游生物由三个主要类群组成：原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类。异养型的微微型光合浮游生物主要为不产氧光合细菌(anoxygenicphototrophicbacteria,APB)。蓝细菌(Cyanobacteria)中的一属，为原核生物，粒径一般为0.6μm左右，其主要特征色素为二乙烯基叶绿素(DiVinyl-Chlorophyll,DVChl)。蓝细菌中的一属，为原核生物，粒径一般为1μm左右，除了含有叶绿素a(Chlorophylla)外，其主2要特征色素为藻胆蛋白(phycobiliprotein,PBP),cyanin,PC).包括藻红蛋白(phycoerythrin,PE)和藻蓝蛋白(phyco-微微型真核藻类picoeukaryotes;Euk.由多种隶属于不同门类的真核浮游植物组成，粒径范围在0.2μm～2μm,它们的主要色素为叶绿4方法原理本方法是一种在单细胞水平上对微微型光合浮游生物细胞物理化学和生物化学性质进行快速测定的方法。含有荧光物质的微微型光合浮游生物细胞在检测区受激光照射后，产生前向散射光、侧向散射光和荧光。前向散射光信号表征细胞的大小和形状，侧向散射光信号表征细胞质的颗粒性，荧光信号表征细胞的荧光物质含量。根据原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类上述信号的不同进行区分和计数。5主要仪器设备主要仪器设备如下：a)流式细胞仪(配备488nm激光器);b)液氮罐；c)超低温冰箱(-80℃);d)漩涡振荡器。6试剂6.1固定剂样品可采用多聚甲醛溶液(固定终浓度为1%)或戊二醛溶液(固定终浓度为0.1%)进行固定，也可同时加入多聚甲醛溶液和戊二醛溶液进行固定(固定终浓度分别为1%和0.05%)。多聚甲醛溶液和戊二醛溶液获得方法如下：a)多聚甲醛溶液：市售电子显微镜用多聚甲醛溶液或自制10%多聚甲醛溶液。自制10%多聚甲醛溶液配置方法是：在通风橱中称取10g多聚甲醛粉末放入70mL煮沸的蒸馏水中，连续搅拌至少2h(可使用恒温磁力搅拌器);加入少量氢氧化钠(NaOH)溶液(0.1mol/L)直至溶液澄清；加入10mL10%的磷酸盐缓冲液(PBS),调节到pH7.5;定容至100mL;用孔径为0.2μm的注射器过滤器过滤。过滤后的多聚甲醛溶液可分装于15mL的小管中，—20℃保存。未冻结的多聚甲醛溶液(4℃保存)使用不宜超过1周。b)戊二醛溶液：市售电子显微镜用25%或50%戊二醛溶液。注：上述固定终浓度均为体积百分比。鞘液宜使用经孔径0.2μm滤膜过滤的现场海水，也可使用超纯水。6.3标准荧光小球(beads)悬浮工作液用超纯水稀释直径1μm的标准黄绿荧光小球悬浮液至浓度约为10⁵个/μL的工作液。3GB/T30737—2014注：标准荧光小球在流式细胞测定时能产生固定强度的红色和橙色荧光，而且小球颗粒大小固定，因此可作为荧光和散射光信号的内部参考物质。7样品采集与处理7.1样品采集按GB/T12763.6—2007中7.1.1、7.1.2的规定进行。7.2采水量每次采水量宜不少于30mL。7.3样品固定与保存7.3.1水样应先用孔径20μm筛绢预过滤至润洗2次～3次的清洁小烧杯中。7.3.2可在12h内上机分析的样品，可置于4℃避光保存。7.3.3样品固定保存方法如下：a)吸取预过滤水样至2mL或5mL的冻存管中，加入固定剂(见6.1a)或6.1b)],用漩涡振荡器(见第5章d)]充分混匀，用铝箔纸包裹好，避免光照；b)在室温下放置15min后，置于液氮(见第5章b)]中速冻，然后转移到一80℃超低温冰箱[见第5章c)]保存或直接存放在液氮(见第5章b)]中直至分析。7.4记录将采样情况记录于表A.1。8测定步骤8.1测定准备8.1.1将鞘液(见6.2)置入流式细胞仪(见第5章a)]中，当使用过滤海水作为鞘液时，宜短接仪器内的鞘液过滤器以防止鞘液过滤器受污染。若不短接鞘液过滤器，当鞘液过滤器受污染导致背景噪音增多和流路不稳定等情况时，应更换鞘液过滤器。8.1.2开机预热。8.2测定方法8.2.1流量校准法进行流量校准，方法如下：进样管中加入过滤海水或超纯水，测量样品重量；卸下进样针的针管套，待鞘液滴从进样针中滴下，在下一滴鞘液滴滴下前放上进样管，还原托架位置，同时开始计时；至少10min后取下进样管，同时停止计时，记录测定时长，测定剩余样品的重量。流量计算用式(1):4式中：T——测定时间，单位为分(min);W;——初始重量，单位为毫克(mg);W.——测定后所剩重量，单位为毫克(mg);d——进样管内液体密度，单位为毫克每微升(mg/μL)。注：过滤海水d=1.03mg/μL,超纯水d=1.00mg/μL。冷冻保存样品置于常温或37℃水浴中避光解冻备用。标准荧光小球悬浮工作液(见6.3),用漩涡振荡器[见5d]]混匀。将装有水样的进样管放置于样品托架上后开始进样。设定仪器各散射光和荧光通道的电压值，在红色荧光通道设定阈值，保证目标细胞群出现在分析图谱中。电压值的大小应视样品散射光和荧光信号的强弱而定。注：一般各散射光和荧光通道电压参考值为：前向散射FSC为E01(个别仪器型号需设定具体电压值),侧向散射SSC为420V,绿色荧光FL1为630V,橙色荧光FL2为550V,红色荧光FL3为600V,红色荧光FL3阈值为50V。所有电压信号设定为对数放大模式(Log档)。选择流量档，流量宜控制在10μL/min～30μL/min范围内，采集颗粒速度50个/s～100个/s为宜。稳定至少15s后开始采集数据，采集数量宜大于10000个颗粒。记录样品分析时仪器的电压设置。流量校准法为仲裁方法。除本方法外，另有内标法(见8.2.2)。标定标准荧光小球悬浮工作液(见6.3)的浓度。标定方法可使用荧光显微镜直接计数法。标定前用漩涡振荡器(见5d)]混匀，防止荧光小球凝聚沉底。有条件者可使用绝对计数管，绝对计数管内含有已知数量的标准小球，不需对标准荧光小球悬浮工作液(见6.3)的浓度进行标定。样品解冻、加样、进样、仪器参数设定、流量档选择和数据采集按照～规定的步骤进行。9结果分析与计算9.1不同类群细胞的区分根据各细胞群光散射信号和荧光信号(橙色荧光和红色荧光，分别表征藻胆蛋白和叶绿素含量)的差异区分原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类。(当使用超纯水作为鞘液时，会对散射光/荧光信号的绝对值产生一定影响，但对于各细胞类群散射光/荧光信号的相对强弱无显著影响，不影响细胞类群的区分与计数。)前向散射光、侧向散射光和红色荧光信号强度大小依次为：微微型真核藻类>聚球藻>原绿球藻；橙色荧光信号强度大小依次为：聚球藻>原绿球藻≈微微型真核藻类。流式细胞分析图谱中细胞类群的区分见示意图1。5红色荧光红色荧光橙色荧光红色荧光红色荧光橙色荧光前向散射光侧向散射光橙色荧光侧向散射光图1流式细胞分析图谱中原绿球藻、聚球藻和微微型真核藻类区分示意图9.2获取细胞数在仪器分析结果的散点图上圈出目标细胞群，仪器自带的分析软件将自动给出该类群细胞的数量，做好记录。9.3细胞密度计算9.3.1使用流量校准法时，样品中每个类群的细胞密度可用式(2)计算： 式中：C——细胞密度，单位为个每毫升(cells/mL);N——获取该类群的细胞数量，单位为个(cells);V,——样品体积加上添加物(固定剂、标准荧光小球悬浮工作液等)的体积，单位为微升(μL)V、——样品体积(不含固定剂，标准荧光小球悬浮工作液等添加物体积),单位为微升(μL);R——样品流量，单位为微升每分(μL/min);T——样品测定时间，单位为分(min)。9.3.2使用内标法时，样品中每个类群的细胞密度可用式(3)计算：式中：C——细胞密度，单位为个每毫升(cells/mL);Q,——样品中添加的标准荧光小球数量，单位为个；N——获取该类群的细胞数量，单位为个(cells);6N,——获取标准荧光小球数量，单位为个；Vs——样品体积(不含固定剂，标准荧光小球悬浮工作液等添加物体积),单位为微升(μL)。将测定结果和计算结果填于表A.2。7(规范性附录)海洋微微型光合浮游生物测定流式细胞测定法采样和测定结果记录表格式表A.1～表A.3给出了海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定采样和测定记录表格式。表A.1海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定海上采样记录表序号站位采样采样时间水深m水层m样品编号水样体积mL固定剂体积mL编号经度纬度o!M123456789备注校对者：表A.2海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定结果记录表(流量校准法)序号站位样品编号采样日期水层m散射/荧光通道电压V激光功率mW流量进样时间min获取细胞数个样品体积细胞密度前向侧向绿色橙色红色/阈值Pro.无添加物含添加物Pro.123456789备注注1:前向散射光设置为E01时，无需在表中填写具体前向散射电压值注2:“Pro.”表原绿球藻(Prochlorococcusspp.),“Syn.”表聚球藻(Synechococcusspp.),“Euk.”表微微型真核藻类(picoeukaryotes)表A.3海洋微微型光合浮游生物流式细胞测定结果记录表(内标法)序号站位样品编号采样日期水层m散射/荧光通道电压V激光功率mW样品中荧光小球数103个获取荧光小球数个获取细胞数个样品体积细胞密度前向侧向绿色橙色红色/阈值Pro.Pro.123456789备注注1:前向散射光设置为E01时，无需在表中填写具体前向散射电压值。注2:“P