牛出血性败血症诊断技术

ICS11.220

CCSB41

中华人民共和国国家标准

GB/TXXXXX—202X

代替GB/T27530—2011

牛出血性败血症诊断技术

Diagnostictechniquesforbovinehaemorrhagicsepticaemia

点击此处添加与国际标准一致性程度的标识

（征求意见稿）

（本稿完成日期：2023年5月22日）

202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施

GB/T××××—202×

引言

牛出血性败血症（Haemorrhagicsepticaemia，HS）是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm）

某种血清型引起的黄牛和水牛的一种高度致死性的急性败血性疫病，发病率与死亡率极高。牛出血性败

血症可造成巨大经济损失和社会影响，世界动物卫生组织（OIE）将其列为通报疫病，我国将其列为二

类动物疫病。

多杀性巴氏杆菌属于巴氏杆菌科的巴氏杆菌属，是一种两端钝圆的短杆菌或球杆菌，被分为5个荚

膜血清型（A、B、D、E、F）。各荚膜血清型之间的交叉免疫保护反应力弱，因此血清型鉴定是免疫

防控首先要解决的问题。病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结等新鲜病料适于多

杀性巴氏杆菌病原的分离。若动物死亡时间较长，可采集长骨骨髓作为病料。病料涂片镜检结合流行病

学调查及剖检，可进行初步诊断。但慢性病例或腐败病例，须进行体外培养和动物试验。通过对组织或

液体样品进行细菌分离，检测是否存在巴氏杆菌抗原或核酸，以作出诊断。用于巴氏杆菌分型鉴定的方

法有间接血凝试验、琼脂凝胶免疫扩散试验、对流免疫电泳试验和多重聚合酶链式反应（多重PCR），

多重PCR具有敏感性好、特异性强并且快速简便等特点，成为多杀性巴氏杆菌检测的首选方法。

本文件的修订参考了OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准手册》（2018版），转化了相关的巴氏杆

菌诊断方法，补充了分子生物学诊断技术，引入了用于鉴定荚膜血清型的多重PCR方法，并结合我国相

关技术研究新成果制定，在技术上与国际先进技术保持一致。

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GB/T××××—202×

牛出血性败血症诊断技术

1范围

本文件规定了牛出血性败血病（bovinehaemorrhagicsepticaemia，HS）的临床与病理学诊断及病原

学诊断的方法和技术要求，规定了多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida，Pm）聚合酶链式反应（PCR）

鉴定的方法和技术要求。

本文件适用于牛出血性败血症的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本文件的引用而成为本文件的条款。凡注日期的引用文件，其随后所有的修

改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本文件，然而，鼓励根据本文件达成协议的各方研究是

否可使用这些文件的最新版本。凡不注日期的引用文件其最新版本适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件：

AGID：琼脂凝胶扩散试验（agargelimmunediffusiontest）

CIEP：对流免疫电泳试验（counterimmunoelectrophoresistest）

CSY：酪蛋白蔗糖酵母琼脂（casein/sucrose/yeastagar）

HS：出血性败血病（haemorrhagicsepticaemia）

IHA：间接血凝试验（indirecthaemagglutinationtest）

PB：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer）

RBCs：红细胞（redbloodcells）

Pm：多杀性巴氏杆菌（pasteurellamultocida）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

LPS：脂多糖（lipopolysaccharide）

TSA：胰酶大豆琼脂（trypticsoyagar）

TSB：胰酶大豆肉汤（trypticsoybroth）

TAE：三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸（Trisbase、aceticacid、EDTA）

DNA：脱氧核糖核酸

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5临床诊断

5.1总则

警示：对本病的剖检采样过程中应防止病原微生物的扩散和感染，相关操作应符合NY/T18088

541-2002和GB19489-2008的规定，相关人员应采取针对性防护措施。

5.2流行病学

5.2.1传染源：患病动物、带菌动物为传染源，健康畜禽的口腔、扁桃体和上呼吸道存在带菌情况，畜

群中发生巴氏杆菌病而查不出传染源时，一般认为家畜在发病前已经带菌。

5.2.2易感动物：黄牛、水牛、秏牛和奶牛均可感染发病。

5.2.3传播途径：病畜由其排泄物、分泌物排出有毒力的病菌，污染饲料、饮水、用具和外界环境，经

消化道传染给健康家畜；可由咳嗽、喷嚏排出病菌，其通过飞沫经呼吸道发生传染；可通过有伤口的皮

肤、黏膜发生传染；吸血昆虫叮咬也可传播病菌。

5.2.4发病规律：本病的发生一般无明显的季节性。出血性败血症是黄牛和水牛的一种主要疫病，发病

率、病死率均高，寒冷、闷热、潮湿、拥挤、气候剧变、阴雨连绵、圈舍通风不良、营养缺乏、饲料突

变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素。

5.3临床症状

5.3.1败血型：病牛病初体温高达41～42℃，呼吸及心跳加快，鼻镜干裂，皮温不整，食欲减退甚至

废绝；病初便秘，后腹泻，粪便始呈粥样，后为液状并混有黏液、黏膜片及血液，恶臭；有时出现鼻漏

和血尿，腹泻开始后体温下降，不久即死亡；病程多为12～24h。

5.3.2浮肿型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的

炎性水肿，同时伴有舌及周围组织的高度肿胀，舌多伸出齿外，呈暗红色。呼吸高度困难，皮肤和黏膜

发绀，常因窒息或下痢而死；病程多为12～36h。

5.3.3肺炎型：除呈现体温升高等一般性全身症状外，病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状；

体温升高，呼吸困难，干咳，流泡沫样鼻液，后鼻液呈脓性；胸部叩诊有痛感；病初便秘，后腹泻，粪

便恶臭并混有血液；病程一般3～7d左右。

5.4病理剖检

5.4.1败血型：皮下、各部位黏膜、浆膜、肌肉等均有出血点；胸腹腔有大量渗出液。真胃、小肠及大

肠常见出血性炎症，肠内容物稀薄且多混有血液。淋巴结显著水肿；脾点状出血但不肿大。肺淤血、水

肿。

5.4.2浮肿型：咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿，切开水肿部位流出深黄色透明液体，间或杂有出血口

咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润，咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀；上呼吸道黏膜卡他性炎症。

5.4.3肺炎型：胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液，肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜，肺

脏切面呈大理石状。心包与胸膜粘连，内有干酪样坏死物。胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症；淋巴

结肿大，呈紫色，布满出血点，尤以支气管淋巴结与纵隔淋巴结最为明显。

5.4.4依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断，确诊需进行病原学诊断。

6病原学诊断

6.1总则

警示：以下的病原学操作包括涂片染色镜检、分离培养、细菌鉴定等过程中涉及细菌活菌操作，

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应在满足GB19489-2008的BSL-2级生物安全实验室内进行，检测人员应采取针对性防护措施。

6.2组织样品采集

患病动物出现体温升高、呼吸困难、流涕等典型症状时，可采集鼻腔分泌物，及时送检。无菌采集

病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、淋巴结等新鲜病料，及时送检或置冷暗处保存备用。死亡

时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料。可现场制作病料涂片或触片，供染色镜检，样品采集符合

NY/T18088541-2002动物疫病实验室检验采样方法。

6.3染色镜检

慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌，应分离培养后再染色镜检。

6.3.1革兰氏染色

采集病料涂片或触片，在火焰上固定，滴加结晶紫染色液（见附录A.1），染色1min，水洗。滴加

革兰氏碘液（见附录A.2），作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，

立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s；水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干。镜检，

多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌，菌体大小为（0.2～0.4μm）×（0.6～2.5μm）。

商品化试剂盒也可用于革兰氏染色。

6.3.2瑞氏染色

病料涂片待自然干燥后，滴加瑞氏染色液（见附录A.3），固定1min。加入等量蒸馏水（pH6.5），

染色3～5min。用蒸馏水冲洗，待干。镜检，多杀性巴氏杆菌菌体经瑞氏染色时菌体两极浓染，经印

度墨汁染色（见附录A.4）可见明显的荚膜。

6.3.3结果判定

镜检观察到典型菌体，结合流行特点、症状和病变，可初步确定为巴氏杆菌感染，确诊需进行分离

鉴定。

6.4病原分离

6.4.1病料分别接种麦康凯琼脂培养基（见附录B.1）、含5%血清的酪蛋白－蔗糖－酵母（CSY）琼脂

培养基（见附录B.2）或大豆酪蛋白琼脂培养基（见附录B.5）和鲜血琼脂培养基（见附录B.3），置37℃

条件下培养18～24h后，挑选可疑菌落进行鉴定。

6.4.2当病料中细菌含量少时，可用5%血清肉汤或含5%血清的大豆酪蛋白液体培养基（见附录B.6）

于37℃进行增菌培养。

6.5病原鉴定

6.5.1培养特性

6.5.1.1多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长，在血液琼脂培养基上经18～24h后可长成圆

形、光滑、湿润、有灰色白光泽的半透明菌落，直径约1mm，菌落周围无溶血现象。

6.5.1.2在CSY琼脂培养基上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落。老龄培养物，特别是在无血培

养基上的老龄培养物，形成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落。

6.5.2菌体形态

取血液琼脂培养基上生长18～24h的典型菌落涂片，革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌，

菌体大小为（0.2～0.4μm）×（0.6～2.5μm）。

6.5.3生化试验

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取可疑菌株，应用BIOLOG微生物全自动鉴定系统或细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行相关生

理生化指标测定。

6.5.3.1取纯培养的待检菌少许接种发酵管（见附录B.4），置37℃培养，每天观察并记录结果，多杀

性巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气；不发酵棉子糖、乳糖、

鼠李糖、菊糖、肌醇。

6.5.3.2脲酶试验

用接种环蘸取一环新鲜培养物，涂压在含2%尿素的培养基上（见附录B.7），观察颜色变

化。室温保存培养基24h，每5h观察一次。分解脲的菌株可使培养基由黄色变为粉红色。

6.5.3.3吲哚试验

用接种环蘸取一环新鲜培养物接种蛋白胨水（见附录B.8），置37℃培养1~2d，加入柯

凡克试剂（见附录A.5）约0.5L，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂（见

附录A.6）约0.5L，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：蛋白胨中应含丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。

6.5.3.4氧化酶试验

新鲜配制氧化酶试剂，配制方法见附录A.7，取约载玻片大小的滤纸条在该试剂中浸渍后

置于平皿中备用。用接种环蘸取一环新鲜培养物，涂压在准备好的滤纸条上，10s后观察颜色

变化。氧化酶阳性可使涂压培养物处变为黑色。

6.5.3.5硝酸盐还原试验

配制硝酸盐培养基（见附录B.9）、硝酸盐还原试剂（见附录A.8），将分离到的细菌接种

硝酸盐培养基，37℃培养1~4d，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐

时于立刻或数分钟内显红色。

6.5.3.6硫化氢试验

将H2S试纸条放入接种培养物的斜面培养基管内，夹在管壁和塞子之间，且不与培养基接

触。置于37℃培养箱中培养，若有H2S产生，则试纸条顶端变黑。每天记录结果并更换试纸

条，持续4天。

6.5.3.7依据病原培养特性、菌体形态、生化试验，符合多杀性巴氏杆菌特征者可做出确定诊

断（表1）。需制定紧急免疫程序时，建议进行血清分型试验和动物接种试验。

表1.多杀性巴氏杆菌生化反应结果

菌名脲酶吲哚氧化酶硝酸盐还原试验H2S试验

多杀性巴氏杆菌-+++-

6.5.4血清分型试验

6.5.4.1间接血凝试验

6.5.4.1.1器材

a）80孔血凝反应板（大孔板）。

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b）微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。

6.5.4.1.2试剂

a）标准菌及待检菌荚膜抗原（见附录C.1、C.6）。

b）特异性抗血清（见附录C.2）。

c）1%新鲜绵羊红细胞（见附录C.3）。

d）致敏绵羊红细胞（见附录C.4）。

e）阿氏液（Alsever's液）（见附录A.9）。

6.5.4.1.3操作方法

a）反应板每排第1孔加入含0.3%甲醛的0.85%NaCl溶液0.72mL，自第2孔起各孔分别加入0.85%

NaCl溶液0.4mL。

b）各型特异性抗血清各自单独一排稀释，第1孔加入血清0.08mL，混匀，移取0.4mL到下一孔。

同样方法稀释至第7孔。

c）每孔加入0.4mL致敏绵羊红细胞。

d）同时设如下对照：

—血清对照：血清（10倍稀释0.4mL+加1%新鲜绵羊红细胞0.4mL。

—绵羊红细胞对照：1%新鲜绵羊红细胞0.4mL+含0.3%甲醛的0.85%NaCl溶液0.4mL。

—抗原对照：1%致敏绵羊红细胞0.4mL+含0.3%甲醛的0.85%NaCl溶液0.4mL。

—反应程序见表2。

表2间接血凝试验（荚膜分型）反应程序

加样后，轻微震荡，置室温，分别于2h~l8h判读并记录结果。

6.5.4.1.3结果判定

绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为阳性，在孔中央形成钮扣状为阴性。依据凝集范围的大小

判定凝集程度为以下几级：

a）“++++”凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底，边缘不整齐，示100%凝集。

b）“+++”凝集的绵羊红细胞平铺孔底，但有卷边或缺口，示75%凝集。

c）“++”凝集的红细胞平铺孔底，呈片层或沙撒布样，分布不均匀，边缘不整齐，示50%凝集。

d）“+”绵羊红细胞凝集面积较小，凝集程度轻微，边缘稍增厚，示25%凝集。

e）“一”绵羊红细胞沉积在孔中央，如小圆盘或钮扣状，示无凝集。

以"++"为样品的滴度终点。当抗原与抗血清之间出现明显50%或50%以上凝集者，判读为阳性，

抗原与抗血清之间出现25%或无凝集者，判读为阴性。未知菌株用具有凝集性的抗血清进行鉴定，若

与所有血清都没有发生凝集反应，则用该方法对菌株无法分型。

6.5.4.2琼脂凝胶免疫扩散试验

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GB/T××××—202×

6.5.4.2.1材料

a）平皿。

b）打孔器。

c）针头。

6.5.4.2.2试剂

a）琼脂凝胶平板（见附录A.17）。

b）菌体抗原（见附录C.5）。

c）多杀性巴氏杆菌菌体分型血清，1~16个血清型（见附录C.2）。

6.5.4.2.3操作方法

a）打孔：琼脂冷凝后打孔，孔径4mm，孔距6mm，每组7孔，如图1所示。孔内琼脂小心用

针头挑出，以防破坏周围琼脂，随后用酒精灯加热封底。

图1免疫琼脂双向扩散打孔示意图

b）加样：中央孔加待检抗原（见附录C.5），不同菌体型特异的抗血清加入周边孔内（以加满不

溢出为度）。

c）感作：加样完毕后，静置10min，然后置带盖湿盒中，在37℃恒温培养箱中反应。24~48h

后观察并判定结果，72h为最终判定时间。

6.5.4.2.4结果判定

将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察。抗原孔与抗血清孔之间出现清晰沉淀线者为阳

性，未出现沉淀线者为阴性。所有能引起出血性败血病的血清型菌株均能与2型抗血清反应，与5型抗

血清也可能发生交叉反应。琼脂凝胶免疫扩散试验也可用于荚膜分型。

6.5.4.3对流免疫电泳试验

6.5.4.3.1主要仪器

a）电泳仪。

b）打孔器。

c）微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）。

6.5.4.3.2试剂

a）荚膜抗原（见附录C.1）。

b）荚膜型性特异性抗血清（见附录C.2）。

c）巴比妥缓冲液（见附录A.12）。

d）对流免疫电泳介质（见附录A.13）。

e）0.85%NaCl溶液（见附录A.16）。

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6.5.4.3.3操作方法

a）琼脂玻片的制备：将12mL电泳介质倾注玻板（57mm×70mm），制成厚度为2~3mm电泳板。

b）打孔：琼脂冷却后打孔，一排7孔，孔径4mm，孔间距7mm，按图2所示。另外设一排对

照组，其组内各孔中心之间的距离为6mm。挑去孔内琼脂，封底。

图2对流免疫电泳试验抗原、抗体加样孔位置图

c）加样：同一组加样孔中，阴极端的孔中加入20µL荚膜抗原，同时在阳极端的孔中加等量的抗

血清。对照组分别用0.85%NaCl溶液与阳性抗血清配对和荚膜抗原与阴性兔血清配对。

d）电泳：电泳槽加入适量巴比妥缓冲液，150V（25V/cm）电泳30min，观察电泳出现的沉淀

线。

6.5.4.3.4结果判定

抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为阳性，不出现沉淀线者判为阴性。

6.5.5动物接种试验

将6.2采集的病料用灭菌0.85%NaCl溶液制成1:10悬液（体腔渗出液可直接用于接种），或用5%

血清TSB培养液（见附录B.6）培养24h，皮下或腹腔接种18~22g健康小鼠4~8只，每只0.2mL。同

时取4~8只清洁级小鼠注射等量0.85%NaCl无菌溶液作为对照。隔离饲养观察。多杀性巴氏杆菌强毒

株多于12~72h内致死小鼠。采集死亡小鼠心血和实质脏器，按6.3染色镜检，按6.4进行病原分离，

按6.5进行病原鉴定。

7多重聚合酶链式反应（多重PCR）

7.1总则

警示：以下的操作涉及细菌活菌的步骤应在满足GB19489-2008的BSL-2级生物安全实验室内进

行，检测人员应采取针对性防护措施。

7.2主要仪器设备

7.2.1PCR扩增仪。

7.2.2高速微型离心机。

7.2.3II级生物安全柜。

7.2.4微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）。

7.2.5稳压稳流电泳仪。

7.2.6水平电泳槽。

7.2.7紫外凝胶成像仪。

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7.3主要试剂

7.3.1PCR试剂:TaqDNA聚合酶、2mmol/L的dNTPs预混液、10×PCRbuffer（缓冲液）。商

品化的PCR试剂盒可用于PCR反应体系的制备。

7.3.2TAE电泳缓冲液：50×TAE贮存液（配制方法见附录A.6），使用前加蒸馏水配成1×TAE

缓冲液。

7.3.3电泳加样缓冲液（见附录A.13）。

7.3.42%琼脂糖凝胶（见附录A.14）。

7.3.5DNA分子质量标准（DNAMarker）：2000bp的商业化DNA梯度标准。

7.4引物

表3.鉴定Pm种、荚膜型PCR所用引物

引物目的基因引物名引物序列（5’-3’）产物

特异性或基因座（bp）

所有PmKMT1KMT1T7ATCCGCTATTTACCCAGTGG384

KMT1SP6GCTGTAAACGAACTCGCCAC

荚膜A型hyaD-hyaCRGPMA5AATGTTTGCGATAGTCCGTTAGA564

RGPMA6ATTTGGCGCCATATCACAGTC

荚膜B型bcbDCAPB-FCATTTATCCAAGCTCCACC760

CAPB-RGCCCGAGAGTTTCAATCC

荚膜D型dcbFCAPD-FTTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC657

CAPD-RCATCTACCCACTCAACCATATCAG

荚膜E型ecbJCAPE-FTCCGCAGAAAATTATTGACTC511

CAPE-RGCTTGCTGCTTGATTTTGTC

荚膜F型fcbDCAPF-FAATCGGAGAACGCAGAAATCAG851

CAPF-RTTCCGCCGTCAATTACTCTG

7.5操作程序

7.5.1样品DNA制备

从平板上选择单个菌落，用灭菌接种环取一环菌，接种到200μL生理盐水中，煮沸10min后冰上

冷却3～5min后，12000rpm离心30s，取1µL上清液作为DNA模板用于PCR扩增（约0.1µg/µL），

或使用商品化的DNA提取试剂盒提取DNA作为模板，DNA模板可置于-20℃保存备用。

7.5.2Pm种和荚膜分型多重PCR

7.5.2.1PCR反应体系配制

采用25L反应体系，扩增体系配制如下：

10

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10×Buffer2.5μL

dNTPs（2mmol/L）5μL

TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL

Pm荚膜A型/B型/D型/E型/F型的分型特异性引1μL

物F（20μmol/L）

Pm荚膜A型/B型/D型/E型/F型的分型特异性引1μL

物R（20μmol/L）

KMT1T7（20μmol/L）1μL

KMT1SP6（20μmol/L）1μL

将取1～2μL核酸样品小心加入装有反应液体的反应管内，用双蒸水补足体积至25μL，盖紧盖子

并做好标记。

7.5.2.2在多重荚膜PCR分型系统中，如果采用巴氏杆菌特异型引物（KMT1T7、KMT1SP6）+A型

Pm特异型引物，或巴氏杆菌特异型引物（KMT1T7、KMT1SP6）+B型Pm特异型引物，或巴氏杆菌

特异型引物（KMT1T7、KMT1SP6）+D型Pm特异型引物，或巴氏杆菌特异型引物（KMT1T7、KMT1SP6）

+E型Pm特异型引物，或巴氏杆菌特异型引物（KMT1T7、KMT1SP6）+F型Pm特异型引物进行PCR

扩增时，出现分型的扩增产物条带不清楚的情况时，从混合物中去除多杀性巴氏杆菌特异性引物

（KMT1T7、KMT1SP6）能改善扩增结果。

7.5.2.3为了观察到更加直观的检测结果，荚膜E型巴氏杆菌的种特异性鉴定与分型特异性鉴定建议

在两个独立的反应体系中进行。

7.5.2.4PCR对照，同时设立阳性对照、阴性对照：阳性对照为标准菌株的DNA，阴性对照为不含DNA

的反应体系。

7.5.2.5PCR扩增程序，将上述加有DNA模板的PCR管，置于PCR仪内进行反应。反应条件如下：

94℃3min预变性；然后进行35个循环的扩增（94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min）；

最后72℃延伸10min，4℃保存。在退火温度不改变的情况下，也可根据商品化的PCR扩增试剂盒

中建议的反应程序进行扩增。

7.5.3电泳检测

7.5.3.1参见附录A.14，配制2%琼脂糖凝胶平板。

7.5.3.2加样，取PCR产物7～10µL与2µL加样缓冲液混匀后加入一个加样孔中，每次电泳同时设

标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照。

7.5.3.3于120~140V稳压电泳20~30min。

7.5.4观察与记录

电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪（或紫外线透射仪）上观察并记录结果。

7.6结果判定

7.6.1试验成立条件

当阴性对照不出现条带、阳性对照出现384bp左右扩增条带，试验成立，参照图3进行判定。

7.6.2结果判定

7.6.2.1检测样品出现384bp左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为多杀性巴氏杆菌核酸阳性；

检测样品未出现目的片段，判为多杀性巴氏杆菌核酸阴性。

7.6.2.2检测样品同时出现约384bp、564bp共2条扩增条带，判为荚膜A型巴氏杆菌核酸阳性。

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GB/T××××—202×

7.6.2.3检测样品同时出现约384bp、760bp共2条扩增条带，判为荚膜B型巴氏杆菌核酸阳性。

7.6.2.4检测样品同时出现约384bp、657bp共2条扩增条带，判为荚膜D型巴氏杆菌核酸阳性。

7.6.2.5检测样品同时出现约384bp、511bp共2条扩增条带，判为荚膜E型巴氏杆菌核酸阳性。

7.6.2.6检测样品同时出现约384bp、851bp共2条扩增条带，判为荚膜F型巴氏杆菌核酸阳性。

图3.多杀性巴氏杆菌多重PCR扩增图谱

8综合判定

8.1临床诊断判定为疑似的易感牛类，可判为疑似牛出血性败血症。

8.2临床诊断判定为疑似牛出血性败血症病例，经第6（病原学诊断）分离出牛多杀性巴氏杆菌，

或7（多重聚合酶链式反应）检测呈阳性，可判定为牛出血性败血症。

8.3临床无明显特异症状的动物，经6（病原学诊断）分离出牛多杀性巴氏杆菌，或7（多重聚合

酶链式反应）检测呈阳性，可判定为携带牛多杀性巴氏杆菌。

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附录A

（规范性）

溶液及电泳介质的配制

A.1结晶紫染色液

结晶紫1g

95%乙醇20mL

1%草酸铵水溶液80mL

将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.2革兰氏碘液

碘1g

碘化钾2g

蒸馏水300mL

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至

300mL。

A.3瑞氏染色液

瑞氏色素0.1g

甲醇60mL

用乳钵研磨溶解。

A.4印度墨汁染色

A.4.1试剂：印度墨汁。

A.4.2操作：将标本与一滴印度墨汁染色液在载玻片上混合，加盖玻片，轻压一下，使标本混

合液变薄，在显微镜下观察。

A.5柯凡克试剂

将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。

A.6欧-波试剂

将1g对二甲氨基甲醛溶解于95mL95%乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸20mL。

A.7氧化酶试验试剂

取1mL蒸馏水于带密封盖离心管中，加入N,N-二甲基-1,4-苯二胺草酸盐约10g，盖好密

封盖，震荡混匀，配制成氧化酶试剂。实验时现用现配。

警示：N，N-二甲基-1，4-苯二胺草酸盐具有毒性，有害健康。

A.8硝酸盐还原试剂

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甲液：将对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。

乙液：将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。

A.9阿氏液（Alsever's液）

葡萄糖2.05g

柠檬酸钠0.80g

柠檬酸0.05g

氯化钠0.42g

上述成分加蒸馏水至100mL，混合过滤，116℃灭菌15min备用。

A.100.2mol/L磷酸盐缓冲液（PB）

NaH2PO4•2H2031.2g

Na2HPO4•12H2071.63g

将31.2g的NaH2PO4•2H20用双蒸水溶解，定容至1000mL，配制成A液；将71.63g的

Na2HPO4•12H20用双蒸水溶解，定容至1000mL，配制成B液；取A液19.0mL，B液81.0mL

混合后摇匀即得0.2mol/L，pH7.4的PB。

A.11巴比妥醋酸盐缓冲液（巴比妥缓冲液）

巴比妥钠29.24g

无水醋酸钠11.70g

0.1mol/L盐酸180mL

用蒸馏水充分溶解，调pH至8.8，加蒸馏水至3L。

A.12对流免疫电泳介质

琼脂糖2.0g

巴比妥钠2.06g

二乙基巴比妥酸0.37g

用180mL蒸馏水完全溶解上述混合物，然后加入0.01%的硫柳汞20mL。

A.13电泳缓冲液TAE（50倍）

三羟甲基甲烷碱（Trisbase）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四乙酸（EDTA）100mL

蒸馏水100mL

将上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至1000mL，置4℃冰箱中备用，如配制1.5%的琼

脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释50倍成TAE缓冲液。

A.142%琼脂糖凝胶板

取2g琼脂糖（电泳纯）加入至100mLTAE缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，冷却至

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GB/T××××—202×

50~60℃，加入终浓度为0.005%GoldView核酸染料（或相当的其它核酸染料），倒入凝胶板

中，在距离底板0.5mm的位置放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔，凝胶的

厚度为4mm，待凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶

面约1mm深的足量电泳缓冲液。

A.151%硫柳汞溶液

硫柳汞（C9H9HgNaO2S）1g

蒸馏水100mL

溶解后，置于100mL瓶中盖塞，室温保存。

A.160.85%NaCl溶液

氯化钠（NaCl）0.85g

蒸馏水100mL

将氯化钠加入90mL去离子水中，充分溶解，加蒸馏水将溶液定容至100mL，高压消毒

灭菌112kPa，30min，保存于4℃。

A.17琼脂平板

取0.9g优质琼脂加入90mL0.85%NaCl溶液中，加热溶化后再加入1%硫柳汞溶液1mL，最后

加入适量0.85%NaCl溶液定容至100mL。冷却至45~50℃，倾注水平放置的洁净载玻片、玻璃片

或平皿（凝胶厚度为2.5~3mm）。

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GB/T××××—202×

附录B

（规范性）

培养基的配制

B.1麦康凯琼脂培养基

称取适量干粉麦康凯琼脂培养基，按使用说明制作培养平板。

B.2酪蛋白－蔗糖－酵母（CSY）琼脂培养基

水解酪蛋白3g

蔗糖3g

酵母浸膏5g

氯化钠5g

无水磷酸氢二钾3g

加蒸馏水至1L，完全溶解后调pH值至7.3~7.4后加人1.5%琼脂，116℃高压灭菌15min，

冷却至45~50℃时加入5%的犊牛血清并倾注平皿制成平板培养基。

B.3鲜血琼脂培养基

牛肉膏5g

蛋白胨10g

氯化钠5g

磷酸氢二钾1g

琼脂粉25g

蒸馏水1000mL

先将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和磷酸氢二钾溶于蒸馏水，调pH至7.4~7.6，再加入琼脂粉，

混匀并高压灭菌后，冷却至50℃时加入无菌脱纤家兔鲜血5%，充分混合后倾注平皿制成平

板培养基。

B.4糖发酵管

蛋白胨10g

氯化钠5g

糖（醇、昔）10g

0.2%溴香草酚蓝溶液2%

蒸馏水1000mL

各成分加热溶于水中并调pH至7.4，分装试管，116℃高压灭菌15min。

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GB/T××××—202×

B.5血清TSA培养基

TSA8.0g

蒸馏水200mL

120℃高压20min，待冷却到50~60℃，加入5%无菌牛血清，混匀后倾注平皿，4℃保存

备用。

B.6血清TSB培养基

TSB6.0g

蒸馏水200mL

120℃高压20min，待冷却到50~60℃，加入5%无菌牛血清，混匀后分装到无菌试管中

使用或4℃保存备用。

B.7尿素琼脂

蛋白胨1g

氯化钠5g

葡萄糖1g

磷酸氢二钾2g

酚红0.012g

琼脂20g

蒸馏水1000mL

尿素20g

将除葡萄糖、尿素和酚红以外的成分配好，并校正pH为6.9，加热溶化，121℃高压灭

菌20min。冷至50~55℃，加入经除菌过滤的尿素溶液，混匀，制备成平板或斜面培养基。

B.8蛋白胨水

蛋白胨（或胰蛋白胨）20g

氯化钠5g

蒸馏水1000mL

充分溶解，分装小试管，121℃高压灭菌20min。

B.9硝酸盐培养基

蛋白胨20g

硝酸钾0.2g

蒸馏水1000mL

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GB/T××××—202×

溶解，校正pH至7.4，分装试管，每管约5mL，121℃高压灭菌20min。

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GB/TXXXXX—201X

附录C

（资料性）

多杀性巴氏杆菌分型抗原及致敏绵羊红细胞的制备方法

C.1荚膜抗原制备

将参考菌株（待检菌株）6~8h肉汤培养物1mL均匀涂布到CSY血液琼脂平皿上（直径

90mm），37℃培养过夜。用3mL含0.3%甲醛的0.85%NaCl溶液将生长物洗下，56℃加热

30min后，4℃3000g离心15min，收集上清液保存于-20℃备用。若没有冷冻离心机，则

1500g离心30min，上清液作为抗原提取物。

C.2不同荚膜型特异性抗血清的制备和处理

C.2.1制备

将CartorA、B、D、E标准菌株分别接种于CSY血液琼脂培养基上，37℃培养18~20h，

用含0.3%甲醛NaCl溶液将生长物洗下，将菌体悬液的浊度调到与布朗氏比浊管的第4管相同。

每间隔3~4d给兔静脉注射菌液一次，注射量分别为0.2mL、0.5mL、l.0mL、1.5mL及2.0mL。

最后一次注射后1周，取0.5mL相同的活菌悬液，给兔皮下或肌肉接种。10d后采血收集血

清，血清保存于-20℃，而常用的少量血清可加入硫柳汞至0.01%，4℃保存。

C.2.2处理

用前将1份压积绵羊红细胞加人3份血清中，室温作用30min，离心去除绵羊红细胞，经

56℃灭活30min即可。

C.3新鲜绵羊红细胞的制备

无菌采取绵羊血液，脱纤后，用6~8倍的0.85%NaCl溶液洗涤3次，每次皆用离心法收

集绵羊红细胞（500g），最后一次收集的绵羊红细胞，应恢复到原血量的一半。置2~8℃保存，

2d内使用。

C.4致敏绵羊红细胞的制备

取3mL荚膜抗原（见附录C中C.l），加入0.2mL洗净的绵羊红细胞（见附录C中C.3），

充分混匀，37℃振荡作用2h，离心去上清，再用10mL0.85%NaCl溶液洗涤一次，离心悬

浮于20mL0.85%NaCl溶液，即为1%的致敏绵羊红细胞悬液。

C.5菌体抗原制备

将细菌接种血液琼脂平板培养24h后，用1mL含0.3%甲醛的8.5%NaCl溶液冲洗并收获

生长物。悬浮液100℃水浴中加热1h，离心弃沉淀，取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗

原。

C.6菌体分型抗血清的制备

12~16周龄公鸡颈中部皮下接种1mL油乳菌苗（油乳菌苗制苗菌株选用分离自牛的6•B

型多杀性巴氏杆菌，制备方法参见《中华人民共和国兽药典》（2005年版三部）“禽多杀性巴氏

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GB/TXXXXX—201X

杆菌病油乳剂灭活疫苗"，3周后胸部肌肉内再接种1mL（在胸骨的两侧各接种0.5mL）。1周

后采血，分血清，并加0.01%硫柳汞或0.06%石炭酸防腐保存。出现交叉反应的血清应弃去。

_________________________________

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GB/T××××—202×

前言

本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。

本文件代替GB/T27530-2011《牛出血性败血病诊断技术》，与GB/T27530-2011相比，除编辑性修

改外，主要技术和内容变化如下：

——增加了引言；

——修订了适用范围；

——增加了规范性引用文件（见第2章）；

——增加了缩略语（见第3章）；

——规范了病原的涂片染色镜检（见5.2、附录A.1、附录A.2、附录A.3）；

——增加了病原的分离培养所用的培养基（见5.3.1、5.3.2.5、附录B.5、附录B.6）；

——删除了MR、VP试验，删除了β-半乳糖苷酶试验，删除了柠檬酸盐利用试验；

——规定了病原的生化特性鉴定方法，并规定了不同生化试验的培养基制备（见5.3.2.3.2~6、见附

录A.5~8、附录B.7~9）,以表格形式列出生化试验鉴定结果（见表1）；

——增加了多杀性巴氏杆菌的多重