（高清版）GBT 41623-2022 化学品 鸟类急性经口毒性试验

化学品鸟类急性经口毒性试验国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、中国检验检疫科学研究院、上海市检测中心、中国化工经济技术发展中心、厦门尹巢科技有限公司、国化低碳技术工程中心、生态环境部南京环境科学研究所、沈阳化工研究院有限公司、贵州省分析测试研究院、广东全庆检测有限公司。林绍霞。Ⅱ本文件主要描述了用于评价化学品对鸟类急性经口毒性的三种试验方法：限度剂量试验、LD₅₀-斜率试验、LD₅o-单一试验。其中LD₀-斜率试验和LD₅o-单一试验是序贯进行的试验。根据是否同时需要精准的经口半数致死量(LD₃o)和剂量-反应曲线的斜率数据来选择具体的试验方法。序贯试验程序的目的在于剂量的设计、试验需求与毒性终点精确度的统一性。序贯试验程序能尽量减少受试鸟的数量。名为SequentialDesignCalculator(SEDEC)的计算机软件可用于帮助设计剂量并计算LD。、剂量反应曲线斜率以及置信区间(见9.2)。这些方法是由1994年在美国佛罗里达彭萨科拉举行的鸟类毒性试验研讨会发起，由SETAC/OECD¹)鸟类毒性试验工作组起草，随后通过欧洲和美国的SETAC公开会议和OECD专家组关门会议讨论后，对序贯试验设计进行修改和完善。该序贯试验设计程序已通过广泛的统计验证。这三种试验方法的适用条件如下。——限度剂量试验：当预测受试物的毒性低，且在限度剂量条件下受试鸟不可能发生死亡时，进行该试验。限度剂量与评估目的对应，通常设定为2000mg/kg。除对照组外，限度剂量下用5只或10只受试鸟进行试验(见图1)。——LD₀-斜率试验：当管理部门或其他要求测剂量-反应曲线斜率，和/或估计LD₃。数据及置信区间时，选用此方法。除对照组外，阶段3或阶段4分别需要24只或34只受试鸟进行试验(见图2)。若计算斜率，可通过经典的剂量-效应试验(USEPAOPPTS850.2100)进行替代计算。——LD₅₀-单一试验：当只需要经口半数致死量数据，而不需要剂量-反应曲线斜率或LDso置信区间时，可选用此方法。可用于估计LD₃物种敏感性分布的百分数并为产品标签提供信息。该试验包括两个阶段，除了对照组外，用14只受试鸟来进行试验(见图2)。LD₅₀-斜率试验和LD₅₀-单一试验由多个序贯执行的试验阶段组成(图2)。本文件中的“序贯设计和序贯试验”是指LD₅o-斜率试验和LD₅₀-单一试验。相关的设计逻辑以及统计原理见附录A。设计LD₅₀-斜率试验得到的参数可用于计算机模拟试验，达到危害性评估的目的。这些参数包括LD₅₀值、置信区间和剂量-反应曲线斜率。在LD₅₀-斜率试验或LD₅₀-单一试验设计的各个阶段中，按照预测的受试物剂量，对1只或多只受试鸟一次性经口染毒，剂量单位为“mg/kg”。这些剂量可用于估算LD₅₀。染毒后观察期14d,但主要依据染毒后三天受试鸟死亡率及毒性症状来选择试验剂量，若出现受试鸟死亡或症状恢复较快，可缩短序贯试验(LD₀-斜率试验或LDs₀-单一试验)最初可用从失败的限度剂量试验(出现一只或多只受试鸟死亡)或其他方式获取的信息开始。对于预测可能具有高毒性的受试物，试验可从阶段1开始，每组4只受试鸟，分别按不同剂量染毒。选择的剂量宜涵盖估计的LDs区间范围(例如以啮齿类动物或其他鸟种的LD数据为依据)。根据阶段1的结果估算LD₀。阶段2使用极大似然估计法(MLE)确定剂量，共10个剂量，每个剂量1只受试鸟。若可从失败的限度剂量试验中估算LD₀,序贯试验也可从阶段2开始，对于LD₅₀-斜率试验可连续进行到阶段3,也可能到阶段4(停止试验的规则见~1)SETAC:国际环境毒理学与环境化学学会(SocietyofEnvironmentalToxicologyandChemistry)OECD:经济合作与发展组织(OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment)1化学品鸟类急性经口毒性试验警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实际经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。本文件规定了鸟类急性经口毒性试验的受试物信息、试验原理、试验方法、试验程序、质量保证与质本文件适用于评价低挥发性、具备足够准确度与灵敏度分析方法的化学物质对鸟类的急性经口毒性。本文件不适用于高挥发性的化学物质的急性经口毒性试验。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I)GB/T21803化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21810化学品鸟类日粮毒性试验GB/T21811化学品鸟类繁殖试验GB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数(正辛醇-水)高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-'Pa至10⁵Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平衡法GB/T27850化学品快速生物降解性通则OECD化学品测试导则No.104蒸气压(VapourPressure)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2一次性经口摄入或在24h内多次摄入受试物后发生的不良反应。摄入受试物的总量。注：表示为受试物的质量(g、mg)或受试物的质量/单位体重试验动物(mg/kg,其中bwt为试验动物体重)。经口半数致死量medianlethaloraldoseLD₅₀由统计学得出的一次性经口摄入受试物后导致50%受试动物死亡的剂量。注：LD值用摄入受试物的质量/单位体重试验动物(mg/kg)来表示。限度试验中上限的剂量。在试验中对多只受试鸟同时进行染毒和观察的时期。注：由前一个试验阶段估算的LDo和斜率可能影响当前阶段的试验设计。同样，由现阶段试验产生的数据也可能影响下一个阶段试验的设计。在某个试验阶段所用剂量的最低数值(mg/kg)。在某个试验阶段所用剂量的最高数值(mg/kg)。公比step用于计算各个剂量的倍增因子。当对多只受试鸟用相同剂量受试物染毒时，出现一部分鸟死亡，另一部分存活的现象。注：部分死亡有时也称作部分反应。当没有设置平行组的单个受试鸟在接受不同剂量的受试物时，出现相邻的低剂量组死亡而高剂量组存活的现象。注：即某剂量受试鸟的致死率高于下一个更高剂量的致死率。这时的剂量值可能接近LD₀值。例如：“0”代表受试鸟存活，“1”代表死亡和有反应的受试鸟，按照剂量递增的顺序进行排列，排列顺序为“0001011111”和“000110111”都表示有一个效应逆转，排列顺序为“0001010111”和“00011010011”都表示有两个效应逆转。进一步示例见附录B。与受试鸟群体健康状况无关的死亡，和由自残行为(如损伤腿或擦伤等)产生的死亡。34受试物信息4.1在试验前，应掌握受试物的下列必备信息：a)按照GB/T21845的方法测定的水中溶解度；b)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229和OECD化学品测试导则No.104的方法测定的蒸气压和亨利常数。4.2可能需要受试物的下列信息：a)结构式；b)纯度；c)受试物在水溶液中的定量分析方法；d)按照GB/T21855的方法测定的水解作用数据；e)光稳定性；f)按照GB/T21852或GB/T21853的方法测定的正辛醇-水分配系数；g)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857和GB/T27850的方法测定的快速生物降解性试验结果。4.3测定4.1和4.2中参数的温度，应在试验报告中予以说明。5试验原理试验由几个独立阶段组成。每个阶段，将受试物按设计剂量(mg/kg)以填喂的方式对所有受试鸟同时染毒。根据各阶段的设计，每只鸟可能摄入不同剂量或多只鸟可能摄入相同剂量(即在此阶段设置了该剂量的平行组)。对于不太可能出现明显危害的受试物，宜按限度剂量试验方法同时对多只鸟染毒。若毒性可预知，宜采用序贯设计试验方法而不用限度剂量试验方法。阶段1和阶段2不设平行剂量，而阶段3和阶段4应设平行剂量。在阶段1中，根据最有效的LD₅估算值(例如啮齿动物的LD₅₀)来设定剂量的范围。后续试验阶段的剂量依据前面所有阶段观察到的死亡数来确定。因此，LD。和剂量-反应曲线斜率的估算同时进行。染毒后，观察14d来计算死亡率。在这期间若出现延迟效应现象则应延长观察期。对于染毒后几天内出现受试鸟死亡的化学品，采用分阶段试验设计最容易进行。对于这类化学品不需等到14d观察期结束，即可开始下个阶段的试验，但应继续观察所有受试鸟。较短间隔后观察到的死亡率可用于确定后续试验阶段的剂量(通常是3d)。受试鸟如有明显的痛苦迹象，应实施安乐死。在某个试验阶段，染毒后前三天通常可得到用于判断受试鸟能否从中毒症状中恢复、死亡率能否增加的足够信息。对于某个试验阶段，通过对第3天的试验期间数据的估算，可在较短时间内完成整个试验的全部剂量设计。若第3天的信息表明，在这个阶段中可能还有受试鸟死亡，则LD₅₀的试验期间估算应延迟到幸存的受试鸟中毒症状有明显恢复。有些情况下可能需要等到14d后才能进行下个阶段试验。根据从全部试验阶段积累的14d结果来进行最终计算。死亡率是本试验方法首要的毒性终点。假设背景死亡率可忽略不计。应设置对照组来监控受试鸟的健康及饲养情况，保证试验结果的可靠性。对照组受试鸟的使用程序和时间在7.3中讨论。试验期间，受试鸟如有明显的痛苦迹象，应实施安乐死。6试验方法6.1仪器设备本试验可采用GB/T21810和GB/T21811中的仪器设备。46.2.1受试鸟的选择首选人工繁育的背景死亡率低且反刍习性低的鸟类物种作为受试鸟。通常符合这些要求的物种有宜捕捉野生鸟类用于试验。如选其他鸟类，应增加该物种的敏感性试验。除鹌鹑外，可用(但不限于)绿头野鸭(Anasplaty-undulatus)等作受试鸟。所用受试鸟应是羽翼成熟，不在繁殖期内。首选野生表型，人工驯化的鸟应来源于相同的繁育种群。为了保持基因的多态性所进行的异系繁殖历史宜明确。若不能用野生表型的鸟，则应从不同表型的混合体中选择，以限制近亲繁殖。从非繁殖期的混合性别组或单一性别组中选择受试鸟，随机分配到各试验组中。使用非繁殖期受试鸟有助于降低由性别不同引起的敏感性差异。不同性别的鸟对某些化学品的敏感性可能不同。各种化学品对不同性别鸟的毒性差异可能不同。若怀疑由性别不同引起敏感性差异，则应按不同性别分别进行试验并分别计算LD₀。6.2.2驯养条件和试验条件本文件的试验方法是在试验的早期阶段每个浓度设置一只受试鸟。如果发生呕吐现象，应至少在试验最初的3d内安置每只受试鸟单独栖息。这样能够单独观察和详细记录每一只受试鸟的行为细节(包括呕吐)。对于如斑胸草雀这样的群居鸟类，应将鸟笼靠近排列，使各鸟之间有视觉和听觉上的互动。对其他鸟种宜如此操作。几种受试鸟单独栖息的最小面积为：鸽3333cm²、绿头野鸭2000cm²、鹌鹑1000cm²、虎皮鹦鹉500cm²和斑胸草雀500cm²。鸟笼底部应有适当大小的网眼，既能使粪便通过，又不影响鸟的活动。鸽、虎皮鹦鹉和斑胸草雀的笼中应有栖木。可通过人工控制温湿度和光照来保持试验条件。鹌鹑和绿头野鸭适宜的温度为15℃~27℃,在试验阶段应减少温度的波动。应通风良好，保证空气至少每小时交换10次，鹌鹑和绿头野鸭的光照周期应是8h/16h(光照/黑暗)。对于其他鸟种，应将光照增加到10h。试验期间提供新鲜饲料和水，保证鸟类自由采食和饮水。应确保饲料的营养成分符合受试鸟生长要求，可使用市售商业化饲料和维生素。在染毒之前14d、染毒期间以及观察期内避免进行药物治疗。同时应定期分析饲料和水质，检查可能影响鸟类健康杂质的含量。6.2.3受试鸟的准备每只鸟应单独进行鉴定。人工繁育的受试鸟在试验开始前至少需要14d适应试验条件和饲料。捕获的野生鸟需要更长的适应期。在适应期内，所有的鸟都应保持健康，笼养受试鸟如果死亡超过5%或野生受试鸟死亡超过10%则不能用于试验。若捕获的野生鸟不能适应试验环境条件，应在捕捉地附近放生。考虑到动物福利及周龄差异、基因组成和健康情况等不可控因素，不宜使用捕获的野生鸟类。野生鸟类在被捕捉、运输和关养期间会受到精神压力，进而可能导致更高的死亡率。对于人工繁育的受试鸟尽可能选择同一周龄。将受试物灌入胶囊或溶解、悬浮在合适的介质中，通过填喂法染毒。通常情况下对于可溶或可悬浮的受试物，首选使用水溶液或水悬液，其次考虑使用食用油溶液或乳状液(如：玉米油),最后考虑其他介5质。使用非水介质前应了解该介质的毒性信息，且不应造成呕吐。根据染毒前24h内所测体重来确定每只鸟的染毒剂量。受试物染毒的方式是单一剂量经口灌胃染毒法。染毒用药体积与鸟的体重保持一定的比例，且每千克体重不应超过10mL。受试鸟在染毒的前一晚应禁食12h～15h。像北美鹌鹑和日本鹌鹑这类体重较大的鸟宜整夜禁食。对体重较小的鸟，整夜禁食可能有害；对于体重50g左右或小于50g的鸟，禁食不超过2h。呕吐影响毒性评估结果，应记录呕吐现象。宜用与粪便颜色明显不同的无毒染色饲料(例如，食用色素亮蓝1号，双4-N-乙基-N-3-磺酸苯甲基氨基苯基-2-磺酸甲苯基二钠盐，CAS号57-55-6),来识别是否呕吐。呕吐是鸟类急性经口试验的一个特点，可能与染毒技术或受试物性质有关。减少染毒体积或改变载体会降低呕吐的频率。尤其是选用雀形目受试鸟时，宜先进行摸索剂量范围的预试验来评估它们的呕吐习性。可通过减少染毒体积、使用胶囊或更换载体来消除或降低呕吐频率。如果仍然存在呕吐现象，考虑更换另一种受试鸟。若没有不呕吐的受试鸟种可用，则不可能精确计算出LD₅₀。唯一可能得出的结论是受试物的LD₅₀大于引发呕吐和死亡的最低剂量。染毒后2h内应持续观察鸟的呕吐情况和临床症状，当天光照期间至少等间隔额外观察三次临床症状，此后14d内每天至少观察一次。然而，观察期的时间跨度不应很快固定。观察应持续到不再有临床症状和死亡发生为止。若某个试验阶段观察期延长，则随后的所有试验阶段应相应延长。明显不是受试物导致的死亡(如物理损伤)应在计算过程中排除。若对照组中有偶然死亡发生，则需要增加对照组的受试鸟(见7.3)。应在染毒前和染毒后第3天、第7天和第14天(或依据试验持续的情况推迟)测鸟的体重变化。在染毒后3d内、3d～7d和7d～14d,每天测量食物消耗量。试验结束时，对全部受试鸟，包括对照组和试验组中存活的鸟进行病理分析，有助于识别偶然死亡和各种中毒症状。若无死亡和明显临床症状记试验期间，若受试鸟有明显的痛苦症状，应实施安乐死。7试验程序7.1限度剂量试验限度剂量试验设计包括按限度剂量同时染毒的试验组5只受试鸟和虚拟染毒的对照组受试鸟。对照组受试鸟的染毒程序和时间在7.3中讨论。染毒后观察14d。观察到受试鸟死亡后，按图1中描述的程序操作。为避免受试鸟因毒性效应而蒙受痛苦所进行的安乐死与观察试验处理组的死亡率同样重要。65只鸟，按限度剂量给药5只鸟，按限度剂量给药结果；0只死亡结果：1只死亡结果：2只～4只死亡结果；5只死亡是存活的鸟是否出现毒性症状否限度剂量给药是进行序贯设计的阶段1进行序贯设计的阶段2死亡率=1/10?否注：不包括对照组的鸟。图1限度剂量试验的程序如果染毒后14d内没有受试鸟死亡，可推断在95%的置信水平下LD₀大于限度剂量，试验结束。失败的限度剂量试验不能得出这个结论，应继续进行序贯设计的阶段1或阶段2。若观察到试验组中有1只受试鸟死亡，没有观察到其他受试鸟出现中毒症状，可再增加5只受试鸟，按该限度剂量染毒。或根据项目负责人和委托方的判断进行序贯设计的阶段2。新增剂量可在14d的观察期结束前开始染毒。若上述限度剂量试验期限延长，只有1只受试鸟死亡，且总数10只受试鸟中，没有观察到其余的鸟出现中毒症状，可推断在95%的置信水平下，LD₀大于限度剂量，毒性试验若在5只受试鸟的试验组里出现1只死亡且其余4只有中毒症状，或有2只～4只死亡，或在10只受试鸟的试验组中出现2只或2只以上死亡，按以下要求和图2中所描述的序贯设计，从阶段2开始若试验组的受试鸟全部死亡(包括安乐死),则使用图2中的序贯设计，开始阶段1试验。增加的剂量组可在14d的观察期结束之前开始。从限度剂量试验到序贯设计的阶段2试验，需要一个试验期间LD₅₀的估算值来确定阶段2的染毒剂量。可使用表1(限度剂量为2000mg/kg)中的LD₅₀剂量的计算方法。附录C中描述了在一个失败的限度剂量试验中在任意限度剂量下计算试验期间LD₅₀估算值的方法。注：在某些情况下，如果染毒剂量不大于限度剂量就无法获得LD。。由于使用高剂量受试物的染毒条件有很多限制，不是总能获得低毒受试物的LD₅o。7基于现有信息评估LDso(例如其他试验或限度剂量试验的结果)阶段14个剂量，每个剂量1只鸟后终止试验并计算LD。阶段210个剂量；每个剂量1只鸟(依据限度剂量试验结果，试验可从阶段2开始)依据阶段1+阶段2的结果，计算试验期间LDg和斜率2个剂量，每个剂量5只鸟如果没有或只出现1个效应逆转，依据阶段1+阶段2的结果，计算试验期问LDgo阶段3b5个剂量，每个剂量2只鸟如果出现2个或更多个效应逆转，或山现2个或更多个部分死亡如果出现0或1个效应逆转，且出现0或1阶段4注：LD₃₀-斜率试验和LD₅o-单一试验，不包括对照组的鸟。图2序贯设计试验的程序表1由2000mg/kg的限度剂量试验死亡率得出序贯设计阶段2试验中使用的LD₀的试验期间估算值LD₅o/(mg/kg)7.2LD₅₀-斜率试验和LDso-单一试验本节(7.2)详细说明了序贯试验每个阶段的剂量设计。图2给出了序贯设计中鸟类染毒详细流程。图3列出了4个阶段的取样时间，各阶段观察期均为14d。对照组的试验程序和时间在7.3中讨论。8阶段1受试鸟的观察阶段2受试鸟的观察阶段3b受试鸟的观察d036阶段4受试鸟的观察第6天-一应用阶段1、阶段2的有效数据，设计阶段3b的试验剂量第3天-一应用阶段1的有效数据，设计阶段2的试验剂量图3观察期为14d的4个阶段(阶段1、阶段2、阶段3b和阶段4)序贯设计的取样时间可根据已知受试物毒性信息(如对哺乳动物毒性的试验数据)或同类化学品中结构相似化合物的相关信息来估算最初的LD₅值。对于每个试验阶段，应重新计算最低剂量、最高剂量和公比，以便确定该阶段的剂量序列。极大似然估计法(MLE)是计算模型参数值的程序。对于本试验方法，确定的参数是斜率和概率模型的截距，用于计算LD₅₀。极大似然估计法(MLE)的运用条件是至少有2个部分死亡或2个效应逆转。如果条件符合，序贯设计可根据试验阶段1、阶段2(若至少有2个效应逆转)及更高阶段(若至少有2个效应逆转或至少2个部分死亡)的毒性反应来使用极大似然估计法(MLE)计算LD₅₀和斜率。确定效应逆转和部分死亡对正确进行随后几个阶段的试验至关重要。效应逆转和部分死亡作为是否进行下个阶段试验或停止(完成)试验的判据。宜先统计部分死亡的个数，如果有必要再计算效应逆转个数。附录B中给出有部分死亡和效应逆转的假设检验结果的例子。7.2.2序贯设计详述序贯设计各阶段计算公式中的变量、代号～和图1、图2中描述了停止试验的规定，对序贯设计的描述见附录A。序贯涉及各阶段计算公式中的变量、代号如下：dose。——剂量0,当最低试验剂量出现死亡时，试验期间LD₀的计算中增加剂量0;dose₁——剂量1,第1个剂量；dose₂——剂量2,第2个剂量；doseg——剂量3,第3个剂量；9dose₄——剂量4,第4个剂量；doses——剂量5,第5个剂量；doseio——剂量10,第10个剂量；dose;——剂量；,第i个剂量；hdose——最高剂量；ldose——最低剂量；LDoie—-LD的最初估算值；LD₅o—-试验期间LD₀;slope.——试验期间斜率；step——公比。阶段1——在LDs₀最初估算值附近按对数值等比设4个染毒剂量阶段1中最低剂量、最高剂量和公比的计算如下。a)使用下面的公式计算试验处理组的低剂量和高剂量，其中LD₀的最初估算值是根据啮齿类动物或其他物种毒性试验的LD₅得出，也可从表1中失败的限度剂量试验中得出(附录C中包括限度剂量不是2000mg/kg时LD₅₀的计算): hdose=dose₄=7.071×LDsoi.e b)若hdose>3330mg/kg,则设定hdose=3330mg/kg(若受鸟体自身条件的限制，可低于此值),且重新计算ldose:ldose=hdose/50………(3)c)计算公比：step=50¹/3=3.679……(4)d)计算剂量2和剂量3: f)观察受试鸟一段时间(通常是3d),记录死亡或存活情况。计算“试验期间LD₀估算值”(见表2)。这个试验期间LD₅估算值将用于设计阶段2的染毒剂量。g)继续观察11d(总共14d)。h)若第3天的信息表明这个阶段还可能有更多鸟死亡，可推迟计算试验期间LD₀估算值，直到剩余受试鸟明显恢复。有些情况下，需要等14d后再进行下个阶段的试验。如果前期计算试验期间LD₅₀的观察期延长，则所有后续阶段都要延迟。若14d后有延迟效应现象，则试验阶段可进一步延长。表2通过阶段1的4个剂量计算试验期间LD₅0b从阶段1数据得到的试验期间LDs₀OOOOOOOXOOXOOXOOGB/T41623—2022表2通过阶段1的4个剂量计算试验期间LDsob(续)dose₁从阶段1数据得到的试验期间LD₅oXO)OOOXXOXXOXXOOOXOXXOXOXOOXOXXXXOXXXXOXXXXOXXXX用“O”表示存活，用“X”表示死亡。虽然在试验中只用了4个剂量[剂量1～剂量4(dose₁~dose₄)],但在表中提到了剂量0～剂量5(doseo~doses)。这些数值用于实际试验剂量的上一步或下一步的剂量。即：doseo=dose₁/step,doses=dose₄×step。当最低试验剂量出现死亡时，试验期间LD₅₀的计算应增加剂量0;最高试验剂量出现存活时，增加剂量5。阶段2——在阶段1或有部分死亡的限度剂量试验中得出试验期间LD₀估算值附近设10个等比对数染毒剂量阶段2中最低剂量、最高剂量和公比的计算如下。a)使用下面的公式计算试验处理组的低剂量和高剂量，其中试验期间LD估算值是依据阶段1的试验结果，依据表1中失败的限度剂量试验值(附录C包含的限度剂量不是用2000mg/kg时的LD₅估算),或是综合依据限度剂量试验和阶段1的结果：ldose=dose₁=0.3425×LDs₀* hdose=doseio=2.919×LDso (8)b)若hdose>3330mg/kg体重，则设置hdose=3330mg/kg(若受鸟体自身条件限制，可低于此值),并且重新计算最低剂量：ldose=hdose/8.5………(9)c)计算公比：step=(hdose/ldose)1/s…(10)d)计算中间的8个剂量：dose;=ldose×step+D,i=2～9……(11)e)10只鸟，每只鸟一个计算剂量。f)若进行LDs₀-单一试验，观察14d。采用概率积分转换模型从阶段1、阶段2和限度剂量试验(如果可以获得)得出的最终数据来计算LD₀。g)如进行LD₅₀-斜率试验，观察一段时间(通常3d,若前面的阶段观察期较长或出现延迟死亡则延长观察时间),记录每只鸟的死亡、存活情况。计算效应逆转数量(下个高剂量组的死亡率要比当前剂量组低，见附录B的举例),综合限度剂量试验(若可得)、阶段1和阶段2死亡率数据，使用概率积分转换模型得到试验期间LD₀的估算值，如可能，计算出斜率。若观察到2个或更多剂量的效应逆转，则进行阶段3a,否则进行阶段3b。h)再持续观察11d(总共14d)。i)若第3天的信息表明这个阶段还可能出现死亡，则推迟试验期间LD估算值的计算，直到其他被观察的受试鸟明显恢复。在有些情况下，需要等14d后再进行下个阶段。如果先前计算试验期间LD₅₀的观察期延长，随后所有阶段都要延迟。若14d后仍有延迟效应的现象，该试验阶段可进一步延长。阶段3a——(综合限度剂量试验、阶段1和阶段2的数据，有2个以上效应逆转)在从限度剂量试验(若可得)、阶段1和阶段2试验中得出试验期间LD₅估算值的附近设置2个等对数间隔染毒剂量阶段3a中最低剂量、最高剂量和公比的计算如下。a)若上述的试验期间斜率估计值大于15或小于1,则分别设置为15或1,重新计算最低剂量和最高剂量。若无法计算出试验期间斜率，则试验期间斜率设置为5,重新计算最低剂量和最高剂量。b)使用下列公式计算试验组低剂量和高剂量，其中试验期间LD₅和试验期间斜率是依据当前全部有效数据(限度剂量试验、阶段1和/或阶段2)得出的结果： (12) c)若hdose>3330mg/kg,则设置hdose=3330mg/kg(若受鸟体自身条件限制，可低于此值),并且重新计算最低剂量： d)按最低剂量和最高剂量分别对5只受试鸟染毒，总共10只受试鸟染毒。e)观察14d,记录每只鸟的死亡或存活情况。综合限度剂量试验(若可得)、阶段1、阶段2和阶段3a的死亡数据，使用概率积分转换模型来获得LD₅和斜率的最终计算结果。试验到此结束。f)若概率积分转换模型不合适，在报告中记录，发生50%死亡率区域两侧剂量的几何平均值作为LD₀的值。也可用其他插值法和移动平均数法来计算LD500阶段3b——(综合限度剂量试验、阶段1和阶段2的数据，效应逆转少于2个)在从限度剂量试验(若可得)、阶段1和阶段2中得到的试验期间LDs₀估算值的附近设置5个等对数间隔染毒剂量阶段3b中最低剂量、最高剂量和公比的计算如下。a)使用下列公式计算试验组低剂量和高剂量，其中试验期间LD₅₀是依据当前全部有效数据(限度剂量试验、阶段1和/或阶段2)得出的结果： (16)b)若hdose>3330mg/kg,则设置hdose=3330mg/kg(若受鸟体自身条件限制，可低于此值),并且重新计算最低剂量：ldose=hdose/2.6……(17)c)计算公比： (18)d)计算中间的3个剂量： e)5个剂量，每个剂量2只受试鸟，总共10只受试鸟。f)观察一段时间(通常是3d,若前面的阶段观察期较长或出现延迟死亡则延长),记录每只鸟的死亡或存活。综合限度剂量试验(若可得)、阶段1、阶段2和阶段3b的死亡数据，使用概率积分转换模型来获得试验期间LD₅₀和试验期间斜率的估算值。g)如果观察到至少有2个效应逆转或至少2个部分死亡，并且已获得试验期间斜率估算值，则不需要进行阶段4试验。继续观察直到第14天试验结束，综合限度剂量试验(若可得)、阶段1、阶段2和阶段3b的数据，使用概率积分转换模型来获得LD₅。和斜率的最终计算结果。试验到此结束。h)若不满足g)中描述的条件，则进行阶段4试验。i)再继续观察11d(总共14d)。j)若第3天的信息显示这个阶段可能还会出现死亡，则要推迟试验期间LD₅的估算，直到其他有中毒症状的鸟明显恢复。在某些情况下，需要等14d再进行下个阶段，若此阶段计算试验期间LD之前的观察期延长，则随后所有阶段都延长。若14d后有延迟效应的迹象，这个阶段可进一步延长。阶段4——在从限度剂量试验(若可得)、阶段1、阶段2和阶段3b中得到的试验期间LD₅₀估算值的附近设置5个等对数间隔染毒剂量阶段4中最低剂量、最高剂量和公比的计算如下。a)使用下列公式计算处理组低剂量和高剂量，其中试验期间LD是依据当前全部有效数据(限度剂量试验、阶段1、阶段2和/或阶段3b)得出的结果： hdose=doses=1.6113×LD₅₀v (21)b)若hdose>3330mg/kg,则设置hdose=3330mg/kg(若受鸟体自身条件限制，可低于此值),并且重新计算最低剂量：c)计算公比：step=(hdose/ldose)1/4 (23)d)计算中间的3个剂量： f)观察14d,记录鸟的死亡、存活情况。综合限度剂量试验(若可得)、阶段1、阶段2、阶段3b和阶段4的数据，使用概率积分转换模型来获得LDs和斜率的最终计算结果。试验到此结束。g)若阶段4结束时不能得出极大似然估计，应在报告中记录，发生50%死亡率区域两侧剂量的几何平均值作为LD₅₀值。也可用其他插值法和移动平均法来计算LD₅₀。7.3对照组对照组包括5只来自同批孵化、未经染毒处理的受试鸟。采用与试验组相同的载体(或胶囊)虚拟染毒(不含受试物),保持所有操作条件与试验组相同。对照组受试鸟在染毒前，以及染毒后的第3天、第7天和第14天测体重。在试验组第1次染毒，即限度剂量试验(若有)和/或序贯试验开始的阶段(阶段1或阶段2),同时给对照组虚拟染毒。试验中若出现以下情况，对照组中应再增加5只鸟：a)一个新的试验阶段开始时，如新增受试鸟与最初的受试鸟不是同一批孵化的，应在新阶段的试验开始时，用与新增受试鸟同批次孵化的鸟设置对照组；b)若不同试验阶段的染毒体积不同，按相应体积给对照组虚拟染毒。此类情况往往发生在最高剂量增加时，需要更大的体积来得到合适的溶液/悬浮液；c)在LD₅₀-斜率试验里，如果各阶段开始的间隔时间较长或有变化(例如从3d变为10d),则应在序贯试验中间的试验开始时(在阶段2或阶段3开始时)给对照组受试鸟虚拟染毒。根据最初对照组的情况，可能需要增加对照组受试鸟数量(见第8章)。为此应驯养备用的受试鸟。8质量保证与质量控制试验过程中，若出现一只受试鸟非偶然死亡或由其他原因死亡的受试鸟超过一只，则试验无效。若最初对照组(5只)中有一只偶然死亡，对照组应再增加5只受试鸟，即在试验中对照组受试鸟总数为9数据与报告9.1数据用表格记录并报告每只鸟的试验数据，包括染毒剂量、使用受试鸟数量、中毒症状、死亡数量以及人道方式处死的数量、每只鸟的死亡时间、发生中毒症状的起止时间，体重(在染毒前和染毒后第3天、第7天、第14天测；若由延迟死亡导致观察期大于14d,则在试验结束时再测),饲料消耗和病理学检查结果。9.2LD₅₀、斜率和置信区间的计算序贯试验LD₀的计算方法与其他类型的剂量反应试验相同。基于假设序贯设计的剂量反应曲线接近概率积分转换模型，可用概率回归模型(用剂量的对数作自变量)来计算LD₅₀。在概率积分转换模型中，lg(LD₅₀)的极大似然估计为一a/b,其中a是截距，b是斜率。当试验中所有阶段的死亡数据都已汇总准备分析时，若发现概率积分转换模型不能充分拟合数据，也可选用其他适合的模型。用标准的极大似然估计法拟合数据模型的条件是：观察到有2个剂量出现部分死亡或出现2个效应逆转时才能适用。这些条件(除特殊情况外)大都在序贯设计中存在。若不能得出极大似然估计，则要在报告中说明，此时LD₀的值为发生50%死亡率区域两边剂量的几何平均值，也可使用其他插值法和移动平均数法来计算LD₅o。使用Fieller定理、似然比法或二项式法可得出LD置信区间。许多其他标准统计程序也可用于计算LD₅₀与其置信区间(例如SASR、LogXactR)。仅在LD₅o-斜率试验中报告斜率及LD的置信区间。对于每个剂量-反应试验，报告中应有回归模型拟合优度的指标(例如Pearson拟合优度、似然比卡方Chi-square)描述。对于LDs₀单一试验，可选择是否报告拟合优度量。注：从LD₅o-单一试验的结果中经常能计算出斜率和LD的置信区间。但是由于在试验中所用鸟的数量少且剂量试验报告应包括以下内容。——批号；——纯度；——室温下的稳定性；——挥发性。b)试验方法和试验系统：——试验类型；——试验方法的描述。c)试验操作：——试验分组和设计(试验处理组及平行、对照组的数量、个体或笼舍分组);——驯养条件和分组的过程(持续时间，随机);——染毒方法(经口灌胃染毒/胶囊、载体/溶剂、体积/按鸟体重的百分比);——统计方法的描述。d)试验结果：——死亡(死亡时间、中毒症状);——LD₀、斜率和置信区间的计算(若适用);——中毒症状的开始和终止时间(精确到分钟);——病理检查；——个体的体重数据；——食物消耗数据。GB/T41623—2022(资料性)序贯设计的总则、原理与统计基础耐受性分布理论是对于受试物的某个特定剂量值，受试鸟个体如果摄入的剂量高于该值则死亡，如果摄入的剂量低于或等于该值则存活。这个特定剂量值称作耐受值。假设耐受值对于每只鸟是固定的，但对于不同的鸟类不同。因此可用耐受性分布表征化学品对鸟类种群的毒性影响。选用合适的统计模型可评估鸟类样本的耐受性分布。首先，假设耐受值符合以下呈正态分布的概率积分转换模型：p——受试鸟个体耐受值低于剂量d的概率，即鸟类摄入剂量d后的存活概率；g概率(p)和lg(d)之间相关直线的截距；β——概率(p)和lg(d)之间相关直线的斜率；用概率模型拟合试验数据，得到α和β两个参数的估测值，即参数a和b。受试鸟类种群耐受性分布平均值(LD₅₀)及耐受性分布方差的计算，可从下列公式得出：V=1/b…………(A.3)式中：lg(LD₅₀)—-受试鸟类种群耐受性分布平均值；a——截距(用概率模型拟合试验数据，得到的参数);b——斜率(用概率模型拟合试验数据，得到的参数);V——方差。如果能估算出耐受值分布(即：已估算出α和β值),则其分布的百分率也能计算出来(剂量水平与特定值p相关)。Chapman,P.F.等人推荐了基于不同试验结果的LD₀、斜率和置信区间计算的方法。如果至少两个剂量组出现部分死亡和(或)效应逆转，即可进行斜率估算。整个试验设计包括几个阶段，每个阶段多只受试鸟同时染毒并观察一段时间。这样设计的优点是在试验早期阶段获得的试验期间LD₅和剂量反应曲线斜率估值，有助于进行下个试验阶段的设计，尤其是设置染毒剂量。总体上，对于一个完整的试验，应视具体情况确定进行几个阶段的试验、每个阶段设几个剂量和每个剂量用几只受试鸟等。虽然不同试验阶段染毒剂量数及每个剂量使用鸟的数量可不同，但本文件通过计算机模拟方法建立某些特定的试验设计，并规定试验第一阶段使用4只受试鸟，后续的阶段用10只。假设在试验开始时对LD的初始估算是有效的。在实际操作中，可基于已知理化性质、相似活性成分的毒性或用其他鸟种及哺乳动物试验结果来估测LD₅₀值。也可从限度剂量试验中获得初始估算值。序贯设计中，前三个试验阶段彼此间明显不同。第一个阶段是“范围确定”,主要确定和调整最初的LD₅估算。第二个阶段是更加精确的定位LD₅o。第三个及后续阶段是确定LD₀的置信区间和剂量反应曲线的斜率或进一步减少LD。估算的不确定性。由于不同试验阶段的染毒方式相互交错，相应的试验期间LD和斜率的评估要进行多次重复计算。在每次重复计算中，受试鸟部分死亡的组数或死亡效应逆转数量都可能不同。有可能在试验开始后第3天、第6天和第9天获得试验期间估算结果，但每个阶段的观察时间应持续到14d。在试验结论中，LD₅₀和斜率(若可能，包括置信区间)的最终评估结论应结合(所有阶段)14d试验结果得出。试验的阶段1,在LD₅₀的最初预测值范围内，按照相同的等对数间隔设置4个剂量。在计算机模拟中发现4个剂量按照从高到低顺序，以较大比率设计足以计算试验期间LD,同时为进行斜率评估的后续阶段保留受试鸟。在估算试验期间LD时，按照转换剂量的几何平均数计算，有两个优点：首先，能在有较少信息量的情况下进行合理的估算；其次，能在最低剂量出现死亡或最高剂量有存活的条件下进行试验期间LD₅估算。试验的阶段2,目的是精准估算LD₅并得到斜率的初步估计值。在这个阶段要得出LD。最终值来进行LD₅₀-单一试验和LD₀-斜率试验的一个试验期间估计。在这些试验中，最低和最高剂量应出现1%和99%的死亡率。当假设5个斜率呈正态分布时，耐受性的平均值就是LD₅₀值，标准偏差等于斜率的倒数(1/斜率)。根据美国环境保护局ECOTOX数据库(/Ecotox/index.cfm)要求提交有关杀虫剂试验的历史记录表明