三免疫检测技术的基本原理

第三节免疫检测技术的基本原理抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原.将免疫反应与现代测试技术结合超微量的检测.1.2免疫学检测技术的优点高度的灵敏性高度的特异性.3免疫分析技术的应用常用的诊断技术

血凝试验

酶联免疫吸附试验

胶体金免疫技术

放射免疫分析技术.4凝集试验概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。1.直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。①玻片直接凝集法：定性试验②试管直接凝集法：半定量试验.5试管法半定量试验YYY+

玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512.62.间接凝集法先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如RBC,乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。YYY+→待检样品抗原吸附血球或乳胶颗粒反应凝集物.73.间接凝集抑制试验先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测HCG(妊娠诊断)Y

YY步骤1：将已知抗体与待检标本混匀＋Y

YY

＋步骤2：加入抗原吸附的乳胶颗粒混匀Y

YY抗原吸附乳胶颗粒结果判断：不凝集为阳性结果已知抗体待检标本.8凝集反应.92.沉淀反应

概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。类型：★单向免疫扩散★免疫比浊法★双向免疫扩散★对流免疫电泳.10

单向琼脂扩散试验.11

双向琼脂扩散试验.12

对流免疫电泳.13测吸光度计算抗原或抗体的含量抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关免疫比浊法原理.143.中和反应如抗“O”试验4.免疫标记技术

概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。

特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。.15免疫标记技术酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术.16酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA).17酶及其底物

酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应..18酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酯酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

.192、标记方法

戊二醛交联法

过碘酸盐氧化法.20戊二醛交联法(一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.21戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶.22过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环.23标记免疫物的分离与鉴定1、分离

目的：去除游离酶

方法：盐析、柱层析2、鉴定

抗体活性

酶活性

标记物纯度.24ELISA的种类和变化

（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA

.25.26（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原.27获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的

酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定.28

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法.29

酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法).30包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定.31（三）竞争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。.32用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分.33.34.35.36.37.38.39.40.41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51