结核感染T细胞斑点试验

结核感染T细胞斑点试验目录CONTENTS结核病概况1结核感染T细胞斑点试验2T-SPOT临床应用3结核病概况PARTONEPart1中国结核病疫情现状结核病由结核分枝杆菌引起的慢性肉芽肿炎；以肺结核最常见，也可见于全身各器官。全世界约三分之一的人群感染结核分支杆菌，每年约有900万新发病例，150万人死亡；在传染病死亡中占第二位。中国是结核病高发区，感染人数5.5亿；发病数居全球第二130万/年；死亡人数25万/年仅次于艾滋病；耐药患者10万/年Bangladesh

4%India30%Others28%Philippines3%Pakistan4%Nigeria3%SouthAfrica2%中国15%Indonesia

10%每年新发结核病患者比例一、结核病流行病学接触活动性结核病患者暴露程度不足，结核杆菌被机体清除没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测

X-光/CT扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有TST（PPD）机体被感染受机体免疫力抑制没有临床症状终身处于感染状态潜伏性结核有临床症状具有传染性结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的X-光或CT扫描显示异常

肺外结核难以诊断(特别是儿童)活动性结核5%再次激活30%70%5%Part1中国结核病疫情现状一、结核病免疫方式结核诊断接触史临床症状病原/病理特异性差误诊肺炎、肺癌肺外结核难X射线抗体检测分子诊断结核菌素皮试涂片镜检细菌培养假阳/假阴性高；不能区分既往感染和发病病人卡介苗影响2011WHO建议禁用操作复杂技术要求高肺外结核难取样易受外源性DNA污染卡介苗交叉反应不能区分NTM免疫力低下人群敏感性差不能区分NTM检出率低20%肺外结核难耗时长4-8周检出低50%肺外结核难易受环境污染Part1中国结核病疫情现状一、结核病常规检测技术免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群、药物影响假阴性BCG接种人群，其他环境分支杆菌感染，交叉污染假阳性肺外结核感染、儿童结核感染、潜伏性结核感染等难诊断Part1现有检测手段不能满足临床需求无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫力下降，引起结核，形成医疗事故医疗事故无论活动性结核还是潜伏性结核均需要足够快速、灵敏、简便的检测方法Part1中国结核病疫情现状一、现有检测手段不能满足临床需求结核感染T细胞斑点试验PARTTWO结核分枝杆菌感染的体外免疫诊断新方法具有极高的敏感性及特异性诊断迅速结核感染T细胞斑点试验T-SPOTPart1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验Part2T-SPOT原理γ-干扰素释放试验分析技术（IGRA）结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，结核感染后体内长期存在抗原特异性的记忆性T细胞当再次遇到结核特异性抗原（ESAT-6,CFP-10）刺激时，能迅速活化增殖，释放r干扰素r干扰素是结核分枝杆菌感染后机体免疫应答中最重要的细胞因子Part1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验原理γ-干扰素释放试验分析技术（IGRA）全血检测或结核感染T细胞免疫检测细胞检测或结核感染T细胞检测酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测γ-干扰素水平检测能够释放γ-干扰素的效应T细胞数量T-SPOT技术：利用结核杆菌感染者外周血单个核细胞（PBMC）中存在T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异抗原刺激后分泌r干扰素而设计的T淋巴细胞免疫斑点试验。检测外周血中受结核特异抗原(ESAT-6，CFP-10)刺激释放r干扰素的T淋巴细胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表一个细胞，计算出抗原特异性细胞的频率。Part2T-SPOT原理Part1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验原理用BDCPT管或Ficoll提取液收集外周血单个核细胞并计数，加入至4个微孔（分别为阳性对照孔、A孔：ESAT-6、B孔：CFP-10和阴性对照孔）结核特异抗原（ESAT-6/CFP10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素，孵育。效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围1个斑点=1个效应T细胞洗板，加入显色液，观察结果洗板，加入酶标二抗，孵育1h步骤1步骤2步骤3步骤4Part2T-SPOT原理Part1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验步骤阴性结果阳性结果空白对照抗原AESAT-6抗原BCFP10阳性对照（PHA）一个斑点=一个结核效应淋巴细胞Part2T-SPOT原理Part1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验效果图1、T-SPOT的高特异性来自结核分枝杆菌基因组RD1编码所有的卡介苗均缺失RD1大多数非结核分枝杆菌也缺失RD1（除堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、戈登分枝杆菌、苏氏分支杆菌）结核特异性抗原（ESAT-6、CFP-10）不受卡介苗、NTM干扰特异性美国FDA临床研究数据：特异性97.1%(297/306)国内临床研究数据：特异性94.1%(478/508)Part2T-SPOT原理Part1现有检测手段不能满足临床需求Part1中国结核病疫情现状二、结核感染T细胞斑点试验优点2、T-SPOT的灵敏性灵敏度：美国FDA临床研究数据：灵敏度95.6%(175/183)国内临床研究数据：灵敏度95.3%(624/655)T-SPOT检测单个反应细胞可以检测样品中每一个反应的T细胞即使在免疫功能低下的患者，只要单个的T淋巴细胞有反应，也同样可以被检出T-SPOT检测所有类型的T细胞亚型CD4和CD8细胞均被检测即使HIV患者中CD4细胞被清楚，只要CD8细胞有针对抗原的反应，也同样被检出二、结核感染T细胞斑点试验优点3、试验步骤的优点细胞数量标准化

使实验不受患者免疫状况的影响，确保免疫异常患者的灵敏度不受影响细胞洗涤

去除血液中的背景细胞因子和药物，使特殊药物使用者和γ干扰素分泌异常的患者不受影响三环类抗抑郁症药物、非甾体类抗炎药物、阿贝西普、皮质类固醇类药物等二、结核感染T细胞斑点试验优点4、方法学比较：ELISPOT

VSELISAELISPOTELISA细胞洗涤通过洗涤去除了血液中的背景细胞因子，减少了干扰因素，保证高灵敏度及可靠性无洗涤，本底高，干扰因素多。不适用于本身细胞因子分泌异常的患者及免疫力低下患者细胞计数计数。每个孔加入25万个细胞，实现了检测条件的标准化及前后结果的可比性，并可通过增加血量确保免疫异常患者有足够细胞参加反应，使结果不受免疫功能影响。不计数。每次加入1ml抗凝血，参加反应的细胞数量不恒定，导致无法实现检测条件的标准化，不适用于免疫功能低下者结果报告定量结果+定性结论定性结论结果意义一个斑点代表一个效应T细胞，能反应疗效，可以检出数个有反应的T细胞结果为绝对值，前后没有参考意义，至少需要4000有反应的T细胞才能检测。二、结核感染T细胞斑点试验优点5、方法学比较：T-SPOTVS

TST

结核菌素试验（TST）T-SPOT抗原组成PPD，成分复杂ESAT6，CFP-10便捷度麻烦：2次（注射、读数）便捷：1次（抽血）报告时间48-7216-24试验对象体内体外结果的诊断主观（观察者）客观（基于仪器）卡介苗（BCG）影响是，特异度~56%（34%~78%）否，特异度~95%（93%~99%）非结核分枝杆菌（NTM）影响是否（除堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌、苏加分枝杆菌等少数）灵敏度受免疫力低下/抑制影响基本不受免疫低下/抑制影响二、结核感染T细胞斑点试验优点6、T-SPOT在欧美得到全面推广，并被写入诊疗指南英国（国家卫生和临床协会）；德国（德国抗结核病中央委员会）；瑞士（瑞士肺科协会）；美国（CDC和儿科学会）；法国（国家卫生局）；澳大利亚（国家结核病咨询委员会、传染病协会和澳大利亚风湿病协会）；日本（日本结核病预防协会）西班牙（西班牙肺病和胸部手术协会）；意大利；；荷兰（实用结核病控制委员会）；加拿大（加拿大结核病委员会）；巴西（卫生部）；沙特阿拉伯；韩国二、结核感染T细胞斑点试验优点特异性好，所有的卡介苗（BCG）菌株和大部分环境分枝杆菌的基因中均缺乏RD1序列，因此不受卡介苗（BCG）接种与环境分枝杆菌影响灵敏度高，几乎不受个体免疫功能低下影响标本血液或体液，对肺外结核的诊断尤其有帮助国内外指南推荐不能够提示临床患者的病变部位，需要结合临床的判断目前还不能够根据斑点数量的多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者优点：不足：二、结核感染T细胞斑点试验T-SPOT临床应用PARTTHREE结核感染T细胞试验（T-SPOT）临床应用三、结核感染T细胞斑点试验临床应用科室应用呼吸科胸水鉴别诊断，肺外结核的辅助诊断2周以上的不明原因发热病人的结核感染排筛菌阴肺结核的辅助诊断传染/感染科不明原因发热病人的结核感染排筛HIV病人结核排筛，HIV容易并发结核病风湿免疫科免疫抑制剂使用前的结核筛查（写入由全国风湿病学权威署名的英夫利西单抗治疗前结核预防与管理专家建议）自身免疫性疾病与结核病的鉴别诊断发热待查患者的结核排筛儿科儿童发热结核筛查儿童肺外结核的辅助诊断儿童原发性结核的辅助诊断儿童肺结核——干咳不排痰，其他方法几乎无法诊断三、结核感染T细胞斑点试验临床应用科室应用消化科腹水待查肠结核的鉴别诊断发热待查生物制剂治疗前结核筛查（克罗恩病，炎症性肠病）其他科室神经内科：结核性脑膜炎的辅助诊断肾内科：肾结核的鉴别诊断，血透患者的结核筛查内分泌科：糖尿病患者的结核筛查血液科：血液病治疗前的结核筛查（血液病合并活动性结核）生殖中心：盆腔结核造成不孕不育，试管婴儿手术前的结核排筛骨科：骨结核诊断移植患者，在移植手术前排筛结核，以避免术后病患免疫力下降后引发暴露性结核，引起医患纠纷三、结核感染T细胞斑点试验临床应用风湿免疫科：疫抑制剂使用前的结核筛查写入由全国风湿病学权威署名的英夫利西单抗治疗前结核预防与管理专家建议三、结核感染T细胞斑点试验临床应用肝素抗凝全血5ml（绿头管）

常温送检（不可冰藏、冰冻）

标本要求三、结核感染T细胞斑点试验临床应用报告解读——阳性1.提示患者体内存在结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结核感染。但是否为活动性结核病，需结合临床症状及其它检测指标综合判断。

2.可能是其他分枝杆菌的感染引起，如M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）分枝杆菌。

3.皮下注射PPD也许会造成T-SPOT.TB假阳性结果，因此需同时检